Control Test Kit (Viable Bacteria Selection)

本キットは、生菌由来DNAを選択的に検出するためにViable Bacteria Selection Kit for PCRシリーズを用いて行うEMA処理操作が、検体成分等に由来する反応阻害を受けることなく正しく行われたことを確認するために使用する。Viable Bacteria Selection Kit for PCRシリーズの試薬コンポーネントには、反応確認用のプラスミドDNAがあらかじめ添加されており、検体に対してEMA処理が正しく行われるとこのプラスミドDNAも同時に修飾を受け、PCR増幅できない状態になる。したがって、プラスミドDNA上の領域をターゲットとしてPCR増幅を行うことで、EMA処理操作が阻害を受けずに行われたかどうかを確認することができる。
なお、増幅産物の検出はリアルタイムPCR（qPCR：サイクリングプローブ法で検出）、エンドポイントPCR（アガロースゲル電気泳動で検出）のどちらでも行うことができる。

リアルタイムPCRの場合、増幅産物の検出にはサイクリングプローブ法を採用している。サイクリングプローブ法はRNAとDNAからなるキメラプローブとRNase Hの組み合わせによる高感度な検出方法で、増幅中や増幅後の遺伝子断片の特定配列を効率良く検出することができる。プローブは片方の端が蛍光物質で、もう片方の端がその蛍光物質の発する蛍光を消光する物質（クエンチャー）で標識されている。このプローブは、インタクトな状態ではクエンチングにより蛍光を発することはないが、配列が相補的な増幅産物とハイブリッドを形成した後にRNase HによりRNA部分で切断されることにより、強い蛍光を発するようになる（下図参照）。この蛍光強度を測定することで、増幅産物量をモニターすることができる。



サイクリングプローブ法の原理

（25 μl 反応、50回分）

1.	2×Cycleave Reaction Mixture*1	2×conc.	625 μl
2.	Primer/Probe Mix*2	5×conc.	250 μl
3.	dH2O		1 ml
4.	Positive Control*3		125 μl

*1	酵素、バッファー、dNTP mixtureを含むqPCR/PCR反応試薬
*2	蛍光標識プローブを含んでいるので遮光に留意すること。
*3	Viable Bacteria Selection Kit for PCRシリーズに添加されているものと同一のプラスミドDNA。本キットによるPCR増幅対象領域は、既知の微生物ゲノムDNAと顕著な相同性を有していないことを確認している。

－20℃

リアルタイムPCR 検出の場合

エンドポイントPCR 検出の場合

【その他】

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