レトロウイルスでゲノムに遺伝子を挿入

組換えレトロウイルスベクター作製

■お問い合わせ窓口(B)

TEL:077-565-6999


[サンプル送付先]
タカラバイオ株式会社 CDMセンター 細胞工学研究 受託受付担当 宛て
〒525-0058 滋賀県草津市野路東七丁目4番38号
TEL:077-567-9262
ご注意:伝票の品名に受託名をご記載ください。 お問い合わせフォームは こちら

特長

  • iPS細胞作製にもご利用いただけます
  • 高効率遺伝子発現用ベクターまたは高発現遺伝子導入用ベクターを使用
  • 安定発現細胞作製も承ります

概要

高効率遺伝子導入用レトロウイルスプラスミドベクターpDON-AI-2 DNA高発現遺伝子導入用レトロウイルスプラスミドベクターpMEI-5 DNA高効率かつ高発現遺伝子導入用レトロウイルスプラスミドベクターpDON-5 DNAおよび一過性ウイルス産生システムRetrovirus Packaging Kitを販売しています。
レトロウイルスベクター作製受託サービスでは、これらのプラスミドベクターおよびシステムを用いて、目的遺伝子を挿入した組換えレトロウイルスベクターを作製いたします。

レトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入法は、一般的に以下の利点を持ち、動物細胞への効果的な遺伝子導入法として、多くの遺伝子導入実験に利用されています。
  1. 安定な遺伝子導入細胞株を得ることができる。
  2. ヒト、マウスおよびラットを含む多くの動物細胞に遺伝子導入できる。
  3. 増殖細胞であれば、血球系を含む多くの細胞株に遺伝子導入できる。
  4. 初代培養細胞にも効率よく遺伝子導入ができる。

■レトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入
レトロウイルスゲノムからパッケージングシグナル(ψ)と両端のLTR配列を残し、目的遺伝子が挿入された組換えレトロウイルスベクターは、標的細胞の染色体に確実に目的遺伝子を挿入できるため、長期安定遺伝子発現が期待できます。本受託サービスでは、レトロウイルスの構造タンパク質であるgag-polenvを発現するプラスミドベクターと、組換えレトロウイルスゲノムmRNAを発現する組換えレトロウイルスプラスミドベクターを宿主細胞に同時トランスフェクションすることによって一過性に組換えレトロウイルスベクターを取得します。
gag-pol発現ベクター、env発現ベクター、および組換えレトロウイルスベクタープラスミドを同時トランスフェクションすることによって、細胞内で発現したgag-polタンパク質、envタンパク質、および組換えレトロウイルスゲノムRNAがアセンブルして組換えレトロウイルス粒子が出芽します。エンベロープ遺伝子はマウス、ラットに感染可能なecotropic-env、あるいはヒトを含む多くの哺乳動物細胞に感染可能なamphotropic-envから選択していただきます。トランスフェクションから48時間後の培養上清をフィルターろ過して組換えレトロウイルスベクター液とし、小分け分注して納品いたします。

■チラシをご覧ください。
組換えウイルス作製サービス

サービス内容

    ステップ毎にご注文いただけます。

  • 組換えレトロウイルスベクター作製

  • A. プラスミドベクターの構築    

    ・目的の遺伝子を挿入した発現プラスミドベクター作製
    ・挿入遺伝子のサイズ、挿入接続部位の塩基配列を確認
    pDON-AI-2 DNA、pMEI-5 DNAまたはpDON-5 DNAベクターを使用します。

    B. 組換えレトロウイルスベクターの作製と力価測定
    • 組換えレトロウイルスベクター作製とリアルタイムPCRによる力価測定

      ・組換えレトロウイルスベクターを一過性に産生、ウイルスベクターを含む培養上清をろ過
      ・Retrovirus Titer Setを用いたリアルタイムPCR解析によるウイルスベクター、溶液中のウイルスRNAのコピー数を算出

    • 組換えレトロウイルスベクター作製とネオマイシン(G418)耐性コロニー検出法による力価測定

      ・組換えレトロウイルスベクターを一過性に産生、ウイルスベクターを含む培養上清をろ過
      ・標的細胞に希釈ウイルスベクター液を用いて感染
      ・ネオマイシン(G418)による薬剤選択後、薬剤耐性コロニーを検出し、感染力価を測定

      標的とする細胞に適したウイルスエンベロープを選んでいただきます。マウス、ラット細胞への感染にはエコトロピックウイルスを、ヒトを含む多種の哺乳類細胞への感染にはアンフォトロピックウイルスを選択できます。
      ネオマイシン耐性コロニー検出法の標的細胞には、マウスNIH/3T3細胞またはヒトHT1080細胞を使用いたします。ウイルス力価として得られる数値は、ウイルス液1 mlあたりのネオマイシン耐性コロニー形成能を示します(Neomycin colony forming unit/ml)。
      ウイルスベクターの力価は、測定方法により異なります。また、ウイルスベクター液の組成、測定に使用する細胞や血清などの影響により、同じ方法であっても施設によって異なることがあります。ご了承ください。

  • レトロウイルスベクター感染による遺伝子安定発現細胞の取得
    1. ・組換えレトロウイルスベクターの作製
      ・標的細胞のセットアップ、レトロウイルスベクターの感染
      ・薬剤耐性となった目的遺伝子導入プール細胞の調製
      ・リアルタイムPCR解析による目的遺伝子・発現確認

【オプションサービス】
  • 組換えレトロウイルスベクターの作製(ご希望のスケール)
  • ウイルスベクターの簡易濃縮(20~40倍濃縮)
  • ウイルスベクターの恒常産生細胞の作製(プロデューサー細胞の作製)
  • 安定発現細胞シングルクローンの単離

価格・納期

サービス項目
参考価格参考納期
1. 組換えプラスミドDNAの作製*1¥170,000~/件
※遺伝子長で変動
4~7週間
2-1. 組換えレトロウイルスベクターの作製

[2種類]
10 ml(リアルタイムPCR力価測定)
40 ml(リアルタイムPCR力価測定)


¥1,500,000
¥2,050,000
8~9週間
2-2レトロウイルス感染による遺伝子安定発現株作製*2

[2種類]

¥2,700,000~ 12週間~

*1 目的遺伝子2種としてプラスミドベクター調整が2件発生する場合、調整費用が2件になります。

*2 感染用組換えレトロウイルスベクターの作製、RNA抽出、リアルタイムPCR用プライマー設計・合成および力価測定解析にかかる費用を含みます。目的遺伝子1種の場合、価格について別途ご相談を承ります。

納品物

  • 組換えレトロウイルスベクター液 約10 ml×2種類、参考タイター109~1010 copies/ml
  • 作業報告書
  • 目的遺伝子安定発現細胞株(薬剤耐性プール細胞)の凍結細胞×2種類(レトロウイルスベクター感染による遺伝子安定発現細胞株の場合)

ご注文方法

  • 以下のフォーマットにご記入のうえ、依頼書記載のFAX番号へご送付ください。
    ※ 臨床検体由来細胞への導入をご要望の際は、ウイルス感染否定試験(HIV、HCV、HBV陰性)の結果をご提示下さい。

  • 以下の手続きの後に実際のサービスを開始します。
    手続きに必要な書類(<>内)をダウンロードしてご使用ください。
    1. 挿入遺伝子に関する情報を開示ください。 <遺伝子情報書式用紙 ver.6 : 2つのsheetがあります>
      タカラバイオ遺伝子組換え実験安全委員会への申請に必要な情報(遺伝子産物の性質、塩基配列等)をお知らせいただきます。
      電子ファイルに必要事項をご記載後、こちらにメールでお送りください。フラッシュメモリやCD-R等の媒体での郵送も受け付けます。
      なお、配列情報の郵送、メール送信の際には情報漏洩に充分ご注意ください。(弊社では責任を負いかねます)
      情報の扱いには十分注意を払っております。また、<覚書>には秘密保持条項が含まれていますが、情報開示にあたり、特に、秘密保持契約を必要とされる場合はご用意いたします。
    2. タカラバイオ安全委員会において、開示いただいた遺伝子情報をもとに、必要とされる物理的封じ込めレベルを判断し、折り返しご連絡させていただきます。
      P2レベル以下で扱うことができない場合、サービスをお断りすることになります。

受入サンプル

・プラスミドベクターの構築からの場合プラスミドDNA1 μg以上
・組換えレトロウイルスベクターの作製からの場合プラスミドDNA10 μg以上

ご留意事項

  • 組換えレトロウイルスベクターの取り扱いは、挿入されている遺伝子の全塩基配列が既知で、かつ、その遺伝子が毒性あるいは病原性等を示さず安全であると判断できる場合に限りP2レベルで扱うことができます。本サービスでは、P2レベルで扱うことのできる場合のみ、ご依頼をお受けしています。
  • お客様よりご提供いただいたサンプル・情報および納品物の複製物は、別途期限を定めている場合を除き、業務終了後3ヵ月を経過すると順次廃棄いたします。ご了承ください。

ライセンス情報

L21 pDON Vector
This product is covered by the claims of U.S. Patent No. 6,451,595 and their foreign counterpart patent claims.

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注意事項
  • 本受託サービスは、すべて研究目的として作業を行います。納品物を試験研究目的以外へご使用される場合、弊社では納品物に起因する損失・損害等については一切の責任を負いかねます。納品物によっては、その構成物(例えば、ベクター、蛍光色素など)の使用に制限がある場合がありますのでご注意ください。
  • 納品物に起因して、直接的もしくは間接的に発生したお客様の損害については、明らかに弊社の責に帰すべき事由による場合を除いて、弊社は一切その責任を負いません。

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