PrimeScript RTaseは、M-MLV（Moloney Murine Leukemia virus）由来のReverse Transcriptaseをベースにタカラバイオが独自に開発した新規逆転写酵素で、cDNA合成の最大の阻害要因である逆転写酵素自身のRNAへの非特異的結合を軽減し、さらに逆転写プライマーに対するプライミングの特異性を向上させた新しいタイプの逆転写酵素である。この2つのユニークな特長と本酵素の有する強いディスプレースメント伸長活性により、RNAにとってダメージの少ない42℃の反応温度で、複雑な構造のRNAや長鎖のRNAに対しても極めてバックグラウンドの低いcDNA合成が可能である。本酵素は、長いcDNAの調製や完全長cDNAの割合が高いライブラリー作製に最適である。

－20℃

200 U/μl

20 mM		Tris-HCl, pH7.8
100 mM		NaCl
1 mM		EDTA
1 mM		DTT
50%		Glycerol (v/v)

5×PrimeScript Buffer（cDNA合成用）

250 mM		Tris-HCl, pH8.3
375 mM		KCl
15 mM		MgCl2

Poly(rA)・oligo(dT)_12-18を鋳型／プライマーとし、37℃、10分間に1 nmolの[³H]dTTPを取り込む酵素活性を1 Uとする。

50 mM		Tris-HCl, pH8.3
75 mM		KCl
8 mM		MgCl2
10 mM		DTT
20 μg/ml		(rA)n・(dT)12-18
0.5 mM		[3H]dTTP
0.1%		NP-40

標準プロトコールに従って、ラット脳由来のtotal RNA 100 ngを鋳型とし、Oligo dT Primer 50 pmolおよび本酵素200 unitsを用いて42℃で60分間、1st-strand cDNA合成反応を行った。続いてこのcDNA反応液を鋳型としてPCRを行い、アガロースゲル電気泳動によって12 kbのサイズ位置に明確なバンドが見られることを確認した。

1. 200 Uの本酵素と、1 μgのλDNA-Hind III分解物とを37℃、1時間反応させても、DNAの電気泳動パターンに変化は起こらない。
2. 200 Uの本酵素と、1 μgのsupercoiled pBR322 DNAとを37℃、1時間反応させても、DNAの電気泳動パターンに変化は起こらない。
3. 200 Uの本酵素と、1 μgの23Sおよび16S rRNA混合物とを37℃、1時間反応させても、RNAの電気泳動パターンに変化は起こらない。

組換え体大腸菌で発現、分離精製

• 1st-strand cDNA合成
• cDNAプローブ調製
• RT-PCR