SaCas9を用いた組換えアデノ随伴ウイルスを用いるゲノム編集システム(ワンベクタータイプ)

AAVpro® CRISPR/SaCas9 Helper Free System (AAV2)

  • S. aureus由来SaCas9を使用したワンベクタータイプの組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)によるCRISPR/Cas9システム
  • トランスフェクションが難しい哺乳動物細胞(分裂細胞、非分裂細胞)でゲノム編集が可能
  • AAVベクターによる導入のためP1レベル施設での取扱いが可能
  • AAVベクターによる導入によりCas9のゲノムへの組込みを排除し、オフターゲット効果を軽減
ツーベクタータイプのSpCas9を用いたアデノ随伴ウイルスCRISPR/Cas9システムはこちら
メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
CLN 632619 Z2619N AAVpro® CRISPR/SaCas9 Helper Free System (AAV2)
  • ライセンス
1 Kit ¥150,000
説明書・データシート・ベクター情報
CLN 632618 Z2618N AAVpro® CRISPR/SaCas9 Vector System
  • ライセンス
1 Kit ¥90,000
説明書・データシート・ベクター情報

製品説明

AAVpro CRISPR/SaCas9 Helper Free Systemは、CRISPR/Cas9ゲノム編集に使用するsingle guide RNA(sgRNA)とSaCas9遺伝子を発現するAAV2ウイルス粒子をヘルパーウイルス不要で作製するシステムである。本製品は、Staphylococcus aureus由来のSaCas9を使用した、ワンベクタータイプのアデノ随伴ウイルスCRISPR/Cas9システムであり、クローニングしたsgRNAとSaCas9ヌクレアーゼを同時に発現できる。
Staphylococcus aureus由来のSaCas9は、遺伝子サイズが3.3 kbと、従来から使用されているStreptococcus pyogenes由来のSpCas9(4.1 kb)より約1 kb短い。このため、1つのAAVの中にSaCas9遺伝子とsgRNAを入れることが可能となり、in vitroおよびin vivoでさまざまな細胞に対するゲノム編集を高効率で可能にした。ただし、SaCas9は、SpCas9とはPAM配列(Proto-spacer Adjacent Motif sequence)が異なっており、さらに標的配列の長さは20~22塩基が適当とされているため、sgRNAの設計において、注意が必要である(図2)。

本製品には、SaCas9/sgRNA発現AAVウイルスプラスミド構築に必要な試薬(10回分)、および組換えAAV2粒子作製に必要なpRC2-mi342 VectorとpHelper Vectorが含まれており、これらプラスミドを共にHEK293T細胞へ導入することにより、ヘルパーウイルスを使用せずに、高タイター組換えAAV2ウイルス粒子を調製できる。 ヒトU6プロモーターにより発現するsgRNAは、線状化pAAV-Guide-it-1に1ステップで直接クローニングが可能である。クローニングのための、高効率Ligation Mixと高効率コンピテント細胞Stellar Competent Cellsが含まれており、sgRNAに対応して設計されたオリゴDNAをアニーリング後、簡単に効率良くベクターにライゲーションし、形質転換することができる。またAAV粒子調製用ウイルス抽出溶液も含まれている。
SaCas9とsgRNAを同時に発現するpAAV-Guide-it-1
図1. pAAV-Guide-it-1によるSaCas9とsgRNAの同時発現
pAAV-Guide-it-1のSaCas9とsgRNAの配列図。pAAV-Guide-it-1をパッケージングしたAAVを、標的細胞にトランスダクションすることでSaCas9とsgRNAを共発現する。

SaCas9のPAM配列
図2. SaCas9のPAM配列
SaCas9はPAM配列としてNNGRR(T)を認識し、その3 塩基上流を切断する(Nはどの塩基でもよく、RはAまたはG。
(T)はできるだけ考慮することを推奨する)。また標的配列としては20~22塩基が推奨されており、
SaCas9のsgRNAの設計は、http://benchling.comから可能である。

AAVを用いたSaCas9とSpCas9のゲノム編集効率の比較
図3. AAVを用いたSaCas9とSpCas9のゲノム編集効率の比較
CYP2遺伝子Exon1の2ヵ所の配列を標的として2ベクタータイプのAAVpro CRISPR/Cas9 Helper Free System (SpCas9)(製品コード 632608)と1ベクタータイプの AAVpro CRISPR/SaCas9 Helper Free SystemのsgRNAをそれぞれ設計し、AAVウイルスを作製した。12ウェルプレートに1×105個の細胞を播種し、一晩培養後、SpCas9またはSaCas9のウイルスベクターをそれぞれ1×105 MOI(ベクターゲノム定量法)で感染させた。72時間後に細胞を回収し、ゲノムDNAへの変異導入効率(Indel%)をGuide-it Mutation Detection Kit(製品コード 631448)を用いて比較した(アガロースゲル電気泳動後、デンシトメーターで変異導入の割合を測定)。

内容

AAVpro CRISPR/SaCas9 Helper Free System (AAV2)(製品コード 632619)
1.pAAV-Guide-it-1 Vector (Linear) (7.5 ng/μl)20 μl
2.Guide-it Ligation Components v3
DNA Ligation Mighty Mix
50 μl
Guide-it Oligo Annealing Buffer
1.5 ml
Guide-it Control Annealed Oligos v3 (100 fmol/μl)
10 μl
Guide-it Sequencing Primer 1 (100 pmol/μl)
10 μl
PCR Grade Water
1 ml
3.Stellar Competent Cells(製品コード 636763)
4.pRC2-mi342 Vector(1 μg/μl)20 μl
5.pHelper Vector(1 μg/μl)20 μl
6.AAVpro Extraction Solution
AAV Extraction Solution A1.5 ml×3本
AAV Extraction Solution B150 μl×3本

AAVpro CRISPR/SaCas9 Vector System(製品コード 632618)
1.pAAV-Guide-it-1 Vector (Linear) (7.5 ng/μl)20 μl
2.Guide-it Ligation Components v3
DNA Ligation Mighty Mix
50 μl
Guide-it Oligo Annealing Buffer
1.5 ml
Guide-it Control Annealed Oligos v3 (100 fmol/μl)
10 μl
Guide-it Sequencing Primer 1 (100 pmol/μl)
10 μl
PCR Grade Water
1 ml
3.Stellar Competent Cells(製品コード 636763)
pRC2-mi342 Vector、およびpHelper Vectorは、事前にプラスミドDNAを増幅してご使用ください。

保存

Stellar Competent Cells:-80℃
その他:-20℃
(AAVpro Extraction Solutionは溶解後、室温保存)

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