UMI搭載！ヒトTCRα/β V(D)J可変領域の完全長シーケンスが可能
- イルミナ社次世代シーケンサーを用いたヒトT細胞受容体(TCR)のレパトア解析用ライブラリー作製キット
- 末梢血白血球total RNA 10 ng～1 μg、T細胞RNA 1～100 ng、T細胞 1,000～10,000個からTCRα鎖、TCRβ鎖の配列情報を得るためのライブラリー作製が可能
- 完全長V(D)J可変領域のシーケンス(MiSeq推奨)やCDR3配列のシーケンス(イルミナ社の全シーケンサー使用可能)が可能
- UMIの利用により、PCR増幅バイアスの影響を取り除き、より正確なNGS解析が可能
- UDIの利用により、インデックスホッピングによる他サンプルのライブラリー由来のリードコンタミネーションを防止
製品説明
SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit v2は、イルミナ社次世代シーケンサーを用いたヒトT細胞受容体(TCR)のレパトア解析用ライブラリー作製キットである。本製品はSMARTテクノロジー(Switching Mechanism at 5’End of RNA Template)と5' RACE法の応用によりTCRα鎖、β鎖の完全長V(D)J可変領域の配列を得ることができる。
ヒト末梢血白血球のtotal RNA(10 ng～1 μg)、T細胞の1～100 ng total RNA、あるいはインタクトなリンパ球(精製済みT細胞 1,000～10,000個)から高品質のライブラリーが作製できる。本キットでは、個別の分子バーコード（Unique Molecular Identifier : UMI）を付加することにより、PCR増幅バイアスによる影響を取り除き、より正確で信頼性の高いNGS解析が可能である。さらに、イルミナ社次世代シーケンサーに使用できるユニークデュアルインデックス（Unique Dual Index: UDI）により、インデックスホッピングによる他サンプルのライブラリー由来のリードコンタミネーションを防止できる。
ヒト末梢血白血球のtotal RNA(10 ng～1 μg)、T細胞の1～100 ng total RNA、あるいはインタクトなリンパ球(精製済みT細胞 1,000～10,000個)から高品質のライブラリーが作製できる。本キットでは、個別の分子バーコード（Unique Molecular Identifier : UMI）を付加することにより、PCR増幅バイアスによる影響を取り除き、より正確で信頼性の高いNGS解析が可能である。さらに、イルミナ社次世代シーケンサーに使用できるユニークデュアルインデックス（Unique Dual Index: UDI）により、インデックスホッピングによる他サンプルのライブラリー由来のリードコンタミネーションを防止できる。
ヒトCD3＋ T細胞からの各total RNA量または各細胞数からTRAとTRBライブラリーを作製し、解析した。
| ％ Jurkat RNA spiked in to 100 ng of PBMC RNA | Total read count (TRA/TRB) | Without UMI collapse | With UMI collapse | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| ＃ of TRB raw reads | ＃ of reads for TRBV12‑3-TRBJ1‑2 | Detected percentage of Jurkat reads | ＃ of detected UMIs | ＃ of UMIs for TRBV12‑3-TRBJ1‑2 | Detected percentage of Jurkat UMIs | ||
| 10.0％ | 2,500,000 | 1,565,005 | 397,179 | 25.0％ | 281,280 | 62,629 | 22.0％ |
| 1.0％ | 2,500,000 | 1,422,102 | 47,160 | 3.3％ | 219,776 | 6,426 | 2.9％ |
| 0.1％ | 2,500,000 | 1,366,127 | 5,412 | 0.4％ | 189,580 | 631 | 0.33％ |
| 0.01％ | 2,500,000 | 1,218,025 | 521 | 0.043％ | 196,615 | 74 | 0.038％ |
| 0.001％ | 2,500,000 | 1,331,465 | 909 | 0.068％ | 197,870 | 6 | 0.003％ |
| 0.0001％ | 2,500,000 | 1,409,199 | - | 0％ | 124,149 | - | 0％ |
| 0％ | 2,500,000 | 1,222,245 | - | 0％ | 197,933 | - | 0％ |
2検体のPBMCからtotal RNAとgDNAを精製した。1.6 μgのgDNA（Y社）と100 ngのRNA（本キット、X社）から、それぞれライブラリーを作製した。各社キットの使用により得られたTCR a/bライブラリーのクロノタイプの数を示す。本キットでは、TRAが平均48.7 K, TRBが163 K得られた。(NT: not tested)
内容
- SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit v2 Components
-
Box 1
- Control RNA (1 μg/μl)
- TCR SMART UMI Oligo (48 μM)
Box 2- 10X Lysis Buffer
- 5X Ultra Low First-Strand Buffer
- TCR dT Primer (12 μM)
- SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl)
- RNase Inhibitor (40 U/μl)
- Elution Buffer (10 mM)
- Nuclease-Free Water
- PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/μl)
- 5X PrimeSTAR GXL Buffer
- dNTP Mix (2.5 mM each)
- hTCR PCR1 Universal Forward (12 μM)
- hTCRa PCR1 Reverse (12 μM)
- hTCRb PCR1 Reverse (12 μM)
- hTCRa PCR2 UDI Reverse (12 μM)
- hTCRb PCR2 UDI Reverse (12 μM)
- SMARTer RNA Unique Dual Index Kit – 24U (製品コード 634451)
保存
SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit v2 Components
Box 1：－70℃
その他のコンポーネント：－20℃
（融解後、Box 2中の10X Lysis Bufferは4℃、Elution Bufferは室温に保存）
SMARTer RNA Unique Dual Index Kit - 24U：－20℃
Box 1：－70℃
その他のコンポーネント：－20℃
（融解後、Box 2中の10X Lysis Bufferは4℃、Elution Bufferは室温に保存）
SMARTer RNA Unique Dual Index Kit - 24U：－20℃
本製品以外に必要な試薬、機器（主なもの）
下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。
- PCR増幅およびバリデーション
-
- First-Strand cDNA合成用のPCRサーマルサイクラー
- PCR amplification用のPCRサーマルサイクラー
- [オプション（24 サンプル以上をプールして同時に解析する場合）：SMARTer RNA Unique Dual Index Kit – 96U Set A and/or Set B（製品コード 634452、634457）]
- Qubit dsDNA HS Kit（Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. Q32851）
- Agilent 2100 Bioanalyzer: DNA 1000 Kit（Agilent, Cat. No. 5067-1504）
- Library Quantification Kit（製品コード 638324）
- High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit（Advanced Analytical社, Cat. No. DNF-474）
- Nuclease-free thin-wall PCR tube（0.2 ml；USA Scientific社 Code 1402-4700）
- Nuclease-free-low adhesion1.5 ml tubes（USA Scientific社 Code 1415-2600）またはLoBond tubes（Eppendorf, No.022431021）
- Bead精製
-
- NucleoMag NGS Clean-up and Size Select（製品コード 744970.5／.50／.500）
- 100％ エタノール
- 0.2 mlチューブ用 Magnetic Separation Device（SMARTer-Seq Magnetic Separator - PCR Strip 製品コード 635011）など
- [オプション]96-wellフォーマット磁気ビーズ精製用のデバイス
- Magnetic Stand-96（Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. AM10027）
- 96-well V-bottom Plate（VWR社, Cat. No. 47743-996）
- MicroAmp Clean Adhesive Seal（Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. 4306311）
- 96-well plate用低速遠心機
- その他
-
- シングルチャンネルピペット： 10 μl、20 μlおよび200 μl
- 8連チャンネルピペット： 20 μl、200 μl
- フィルターピペットチップ： 2 μl、20 μlおよび200 μl
- 微量遠心機（1.5 ml チューブ用、0.2 mlチューブまたはストリップ用）
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- 注意事項
- 本ページの製品はすべて研究用として販売しております。ヒト、動物への医療、臨床診断用には使用しないようご注意ください。また、食品、化粧品、家庭用品等として使用しないでください。
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