SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit v2

UMI搭載！ヒトTCRα/β V(D)J可変領域の完全長シーケンスが可能
  • イルミナ社次世代シーケンサーを用いたヒトT細胞受容体(TCR)のレパトア解析用ライブラリー作製キット
  • 末梢血白血球total RNA 10 ng～1 μg、T細胞RNA 1～100 ng、T細胞 1,000～10,000個からTCRα鎖、TCRβ鎖の配列情報を得るためのライブラリー作製が可能
  • 完全長V(D)J可変領域のシーケンス(MiSeq推奨)やCDR3配列のシーケンス(イルミナ社の全シーケンサー使用可能)が可能
  • UMIの利用により、PCR増幅バイアスの影響を取り除き、より正確なNGS解析が可能
  • UDIの利用により、インデックスホッピングによる他サンプルのライブラリー由来のリードコンタミネーションを防止
SMART-Seq mRNAバナー
製品コード メーカー
略称		 製品名 容量 価格（税別） 特記事項 説明書、CoA
データシート
ベクター情報		 参考資料 カート
Takara Code
634478

CLN

Clontech
 SMARTer® Human TCR a/b Profiling Kit v2
化学物質排出把握管理促進法（PRTR法） 安全データシート（SDS）添付
12回 ￥402,000
 説明書・データシート・ベクター情報 個
Z4478N
634479

CLN

Clontech
 SMARTer® Human TCR a/b Profiling Kit v2
化学物質排出把握管理促進法（PRTR法） 安全データシート（SDS）添付
48回 ￥887,000
 説明書・データシート・ベクター情報 個
Z4479N
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製品説明

SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit v2は、イルミナ社次世代シーケンサーを用いたヒトT細胞受容体(TCR)のレパトア解析用ライブラリー作製キットである。本製品はSMARTテクノロジー(Switching Mechanism at 5’End of RNA Template)と5' RACE法の応用によりTCRα鎖、β鎖の完全長V(D)J可変領域の配列を得ることができる。
ヒト末梢血白血球のtotal RNA(10 ng～1 μg)、T細胞の1～100 ng total RNA、あるいはインタクトなリンパ球(精製済みT細胞 1,000～10,000個)から高品質のライブラリーが作製できる。本キットでは、個別の分子バーコード（Unique Molecular Identifier : UMI）を付加することにより、PCR増幅バイアスによる影響を取り除き、より正確で信頼性の高いNGS解析が可能である。さらに、イルミナ社次世代シーケンサーに使用できるユニークデュアルインデックス（Unique Dual Index: UDI）により、インデックスホッピングによる他サンプルのライブラリー由来のリードコンタミネーションを防止できる。
SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit v2を用いたライブラリー作製の概要
図1．SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit v2を用いたライブラリー作製の概要

さまざまなRNA量からのクロノタイプの検出
図2．さまざまなRNA量からのクロノタイプの検出

ヒトCD3＋ T細胞からの各total RNA量または各細胞数からTRAとTRBライブラリーを作製し、解析した。


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表1. SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit v2の感度と再現性
％ Jurkat RNA spiked in to 100 ng of PBMC RNATotal read count (TRA/TRB)Without UMI collapseWith UMI collapse
＃ of TRB raw reads＃ of reads for TRBV12‑3-TRBJ1‑2Detected percentage of Jurkat reads＃ of detected UMIs＃ of UMIs for TRBV12‑3-TRBJ1‑2Detected percentage of Jurkat UMIs
10.0％ 2,500,000 1,565,005 397,179 25.0％ 281,280 62,629 22.0％
1.0％ 2,500,000 1,422,102 47,160 3.3％ 219,776 6,426 2.9％
0.1％ 2,500,000 1,366,127 5,412 0.4％ 189,580 631 0.33％
0.01％ 2,500,000 1,218,025 521 0.043％ 196,615 74 0.038％
0.001％ 2,500,000 1,331,465 909 0.068％ 197,870 6 0.003％
0.0001％ 2,500,000 1,409,199 - 0％ 124,149 - 0％
0％ 2,500,000 1,222,245 - 0％ 197,933 - 0％
PBMC RNAに白血病細胞Jurkat T細胞（TRBV12-3-TRBJ1-2クロノタイプ）のRNAを各濃度（10％、1％、0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％）となるようにスパイクインし、本キットで解析した。100 ng total RNAからTRB CDR3領域を増幅し、イルミナ社NextSeqでシーケンスして、2.5 Mリードを解析した。UMIによるデータ補正をしなかった場合（Without UMI collapse）とUMIによるデータ補正をした場合（With UMI collapse）のスパイクインRNA濃度の検出限界をグレーの網掛けで示している。UMIによるデータ補正がない場合、TRBV12-3の検出限界は0.01％であったが、UMIによるデータ補正を行った場合は、0.001％まで検出できた。

他社キットとの比較
図3．他社キットとの比較

2検体のPBMCからtotal RNAとgDNAを精製した。1.6 μgのgDNA（Y社）と100 ngのRNA（本キット、X社）から、それぞれライブラリーを作製した。各社キットの使用により得られたTCR a/bライブラリーのクロノタイプの数を示す。本キットでは、TRAが平均48.7 K, TRBが163 K得られた。(NT: not tested)

内容

SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit v2 Components
Box 1
  • Control RNA (1 μg/μl)
  • TCR SMART UMI Oligo (48 μM)

Box 2
  • 10X Lysis Buffer
  • 5X Ultra Low First-Strand Buffer
  • TCR dT Primer (12 μM)
  • SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl)
  • RNase Inhibitor (40 U/μl)
  • Elution Buffer (10 mM)
  • Nuclease-Free Water
  • PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/μl)
  • 5X PrimeSTAR GXL Buffer
  • dNTP Mix (2.5 mM each)
  • hTCR PCR1 Universal Forward (12 μM)
  • hTCRa PCR1 Reverse (12 μM)
  • hTCRb PCR1 Reverse (12 μM)
  • hTCRa PCR2 UDI Reverse (12 μM)
  • hTCRb PCR2 UDI Reverse (12 μM)

SMARTer RNA Unique Dual Index Kit – 24U (製品コード 634451)

保存

SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit v2 Components
　　Box 1：－70℃
　　その他のコンポーネント：－20℃
　　（融解後、Box 2中の10X Lysis Bufferは4℃、Elution Bufferは室温に保存）

SMARTer RNA Unique Dual Index Kit - 24U：－20℃

本製品以外に必要な試薬、機器（主なもの）

下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。
PCR増幅およびバリデーション
  • First-Strand cDNA合成用のPCRサーマルサイクラー
  • PCR amplification用のPCRサーマルサイクラー
  • [オプション（24 サンプル以上をプールして同時に解析する場合）：SMARTer RNA Unique Dual Index Kit – 96U Set A and/or Set B（製品コード 634452、634457）]
  • Qubit dsDNA HS Kit（Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. Q32851）
  • Agilent 2100 Bioanalyzer: DNA 1000 Kit（Agilent, Cat. No. 5067-1504）
  • Library Quantification Kit（製品コード 638324）
  • High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit（Advanced Analytical社, Cat. No. DNF-474）
  • Nuclease-free thin-wall PCR tube（0.2 ml；USA Scientific社 Code 1402-4700）
  • Nuclease-free-low adhesion1.5 ml tubes（USA Scientific社 Code 1415-2600）またはLoBond tubes（Eppendorf, No.022431021）
Bead精製
  • NucleoMag NGS Clean-up and Size Select（製品コード 744970.5／.50／.500）
  • 100％ エタノール
  • 0.2 mlチューブ用 Magnetic Separation Device（SMARTer-Seq Magnetic Separator - PCR Strip　製品コード 635011）など
  • [オプション]96-wellフォーマット磁気ビーズ精製用のデバイス
    • Magnetic Stand-96（Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. AM10027）
    • 96-well V-bottom Plate（VWR社, Cat. No. 47743-996）
    • MicroAmp Clean Adhesive Seal（Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. 4306311）
    • 96-well plate用低速遠心機
その他
  • シングルチャンネルピペット： 10 μl、20 μlおよび200 μl
  • 8連チャンネルピペット： 20 μl、200 μl
  • フィルターピペットチップ： 2 μl、20 μlおよび200 μl
  • 微量遠心機（1.5 ml チューブ用、0.2 mlチューブまたはストリップ用）

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注意事項
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