SMART-Seq^® mRNA / SMART-Seq^® mRNA LP

SMART-Seq mRNA LPは、total RNA 10 pg～100 ng、または1～1,000細胞の超微量サンプルからイルミナ社NGS装置用の高品質mRNA-Seq用ライブラリーが調製可能なキットです。高品質・高効率なcDNA合成技術SMART法 （Switching Mechanism at 5' End of RNA Template）を採用しており、完全長mRNA-Seqにおける遺伝子発現定量解析が可能です。また、Unique Dual Index Kit（製品コード 634752、別売り）を用いたマルチプレックスシーケンスにより、インデックスホッピングの影響を軽減することができます。
ライブラリー調製においては、フラグメンテーションやステムループのアダプターライゲーションをシングルチューブで行う弊社独自のシングルチューブワークフローにより、ハンズオンタイムの短縮に加え、操作ミスやサンプルロスを抑制します。
また、データ解析には、ユーザーフレンドリーな解析ツール「Cogent NGS」が無料で利用可能です。

Cogent NGSソフトウェアは下記ページからダウンロードしてください。
Cogent NGS Discovery Software (takarabio.com)
Cogent NGS Analysis Pipeline (takarabio.com)

※分解の進んだ低品質RNAやnon-coding RNAからライブラリー調製を行う場合は、逆転写反応にランダムプライマーを使用するSMART-Seq Stranded Kitをご使用ください。


図1. SMART法によるcDNA合成フロー



図2. SMART-Seq Library Prep Kitによるライブラリー調製フロー



図3. シングルチューブワークフローによるライブラリー調製

本製品は、SMART-Seq v4 PLUS Kitおよび SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencingの製品名が変更となった製品です。
製品名以外に以下に記載されたマイナーチェンジがなされていますが、プロトコールや性能への影響はありません。

1. SeqAmp PCR bufferが SeqAmp CB PCR bufferになり、DNAクリーンアップ時のビーズのペレッティングおよび再懸濁の操作性が向上しています。
2. AfaI、10× AfaI Buffer、0.1％ BSAは含まれていません。
3. Total RNAのインプット量の上限が、10 pg～10 ngから10 pg～100 ngとなっています。
4. 本キットにはIndexが含まれていません。Unique Dual Index Kit（製品コード 634752他）を別途ご購入ください。

SMART-Seq mRNA（製品コード 634772/634773/634470）

Box 1（Store at －70℃）

Control Total RNA（1 μg/μl）

Box 2（Store at －20℃）

SMART-Seq v4 Oligonucleotide（48 μM）
PCR Primer II A（12 μM）
5× Ultra Low First Strand Buffer
SMARTScribe Reverse Transcriptase（100 U/μl）
3' SMART-Seq CDS Primer II A（12 μM）
RNase Inhibitor（40 U/μl）
Nuclease-Free Water
10× Lysis Buffer
Elution Buffer（10 mM Tris-Cl, pH8.5）
SeqAmp DNA Polymerase
SeqAmp CB PCR Buffer（2×）

SMART-Seq mRNA LP（製品コード 634768/634769/634771）

SMART-Seq mRNA（製品コード 634772/634773/634470）

SMART-Seq Library Prep Kit^＊

10× FE
FE Dilution Buffer
Lib Prep Buffer
Lib Prep Enzyme
Rxn Enhancer
Stem Loop Adapters
Amplification Buffer
PrimeSTAR HS DNA Polymerase（5 U/μl）
Nuclease-Free Water

^＊本キットの単品販売はありません。

SMART-Seq mRNA

• Control Total RNA：－70℃
• その他のコンポーネント：－20℃

SMART-Seq Library Prep Kit：－20℃

（10× Lysis Buffer：融解後は4℃保存、Elution Buffer：融解後は室温保存）

Index Kit

• Unique Dual Index Kit (1-24)（製品コード 634756）
  UDI No. U001-U024
• Unique Dual Index Kit (1-96)（製品コード 634752）
  UDI No, U001-U096
• Unique Dual Index Kit (97-192)（製品コード 634753）
  UDI No, U097-U192
• Unique Dual Index Kit (193-288)（製品コード 634754）
  UDI No, U193-U288
• Unique Dual Index Kit (289-384)（製品コード 634755）
  UDI No, U289-U384

PCR増幅およびバリデーション

• First-Strand cDNA 合成専用のPCRサーマルサイクラー
• Double-Strand cDNA 増幅専用のPCRサーマルサイクラー
• Nuclease-free thin-wall PCR tube（0.2 ml；USA Scientific社 Code 1402-4700）または同等のNuclease-free thin-wall PCR tube stripsまたは96-well Plate
• Nuclease-free low adhesion 1.5 ml tube（USA Scientific社 Code 1415-2600）またはDNA LoBind tube（Eppendorf社 Code.022431021）または同等のnucleic acid low-binding tubes
• 96-well Plate用粘着シール Thermo Scientific Adhesive PCR Plate Seals（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AB0558）または 8 tube strips用Cap strips（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AB0784/AB0850）

セルソーティング

• 8-tube strips（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AB0264）またはセルソーティングに適したPCR tube strips, 96-well plates
• （オプション）BD FACS Pre-Sort Buffer（BD社 Cat. No. 563503）
• チューブ・プレート用クーリングブロック（－20℃で保存してあらかじめ冷やしておく）
• Adhesive PCR Plate Foils（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AB-0626）
• ドライアイス（細胞の凍結用）
• （オプション）SMART-Seq HT Kit Lysis Components（製品コード 634439）First-Strand cDNA 合成専用のPCRサーマルサイクラー

SPRI Bead精製

• NucleoMag NGS Clean-up and Size Select（5 ml size：製品コード 744970.5；50 ml size：製品コード 744970.50；500 ml size：製品コード 744970.500）
  ※NucleoMagの代わりにAMPure XP PCR purification kit（Beckman Coulter社 5 ml size：Cat. No. A63880；60 ml size：Cat. No. A63881）も使用可能
• Magnetic Separation Device
12～24サンプル用

0.2 mlチューブ：SMARTer-Seq Magnetic Separator - PCR Strip：製品コード 635011)など
0.2 mlチューブまたはストリップ用遠心機
96-well フォーマット用：Magnetic Stand-96（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AM10027）など
24～96サンプル用

96-well フォーマット用：Magnetic Stand-96（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AM10027）など

1.5 ml用（シーケンス用ライブラリーをプールする場合に必要）

Magnetic Stand（製品コード 631964）または NEB Magnetic Separation Rack（NEB社 Cat. No. 1506S）
8-tube strips（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AB0264）またはPCRラックに固定されNuclease-freeのPCR tube strips、またはセルソーターで動作確認済みの96-well Plate

• 80％ Ethanol（必ず用時調製すること）

その他

• シングルチャンネルピペット：10 μl、20 μl、200 μlおよび1,000 μl
• 8連チャンネルピペット：20 μl、200 μl
• フィルターピペットチップ：10 μl、20 μl、200 μlおよび1,000 μl
• 1.5 mlチューブ用微量遠心機
• 0.2 mlチューブまたはstrip用微量遠心機
• 96ウェル冷却ラック（IsoFreeze PCR Rack, MIDSCI社 Cat. No. 5640-T4、96-Well Aluminum Block, Light Labs社 Cat. No. A-7079など）