Human Cell-Free Protein Expression Master Mix for mRNA

Human Cell-Free Protein Expression Master Mix for mRNAは、mRNAを用いた無細胞タンパク質合成のための試薬です。本試薬には、ヒト細胞由来のリボソーム、翻訳開始および伸長因子、tRNAなど、タンパク質翻訳に必要なすべての成分が含まれています。単一のチューブ内において本試薬にタンパク質をコードするcapped mRNA^＊1を添加し、32℃で数時間インキュベートするだけの簡単な手順でタンパク質合成を行うことが可能です。本製品は、従来の細胞ベースの実験と比較して、目的タンパク質の生産だけでなく、mRNA構築物の評価にも迅速な手段となります。したがって、ワクチン開発などの用途向けに設計されたmRNA構築物のスクリーニングに適しています。
＊1 タンパク質発現にはmRNAにcap構造を付加する必要があります。一般的には、capアナログを使用した共転写キャッピングや、Vaccinia virusまたはFaustovirus由来のキャッピング酵素および2’-O-Methyltransferaseを使用した酵素的キャッピングが使用されます。

図1．mRNA添加による分子量の異なる3種類のタンパク質の無細胞発現検討（elF4G: 170 kDa, FLuc: 61 kDa, ZsGreen: 26 kDa）
図1‐A

A．異なるmRNA添加量におけるタンパク質の発現
Human Cell-Free Protein Expression Master Mix for mRNAに、3種類のキャップ化^＊2および非キャップ化mRNAをそれぞれ1、2、4 μg添加し、32℃で3時間インキュベートした。その結果、キャップ化mRNAの添加においてのみSDS-PAGE（eIF4G、FLuc（赤矢印））、化学発光測定（FLuc）、または蛍光測定（ZsGreen）により目的タンパク質の高い発現が確認された。このことは、本無細胞発現系において、mRNAの発現がキャップ依存的であることを示している。また、いずれのタンパク質も2 μgのmRNA添加によって発現が最大化されることが示唆された。

図1-B

B．異なる反応時間におけるタンパク質の発現
3種類のキャップ化^＊2および非キャップ化mRNAをそれぞれ2 μg添加し、32℃で0、1、2、3、および5時間インキュベートした。その結果、キャップ化mRNAの添加においてのみ目的タンパク質の高い発現が確認され、eIF4Gでは3～5時間、FLucでは2時間、ZsGreenでは5時間でタンパク質の発現が最大化された。このことは、本無細胞発現系において、最適な反応時間がタンパク質によって異なることを示唆している。

図1-C

C．異なる反応温度におけるタンパク質の発現
3種類のキャップ化mRNA^＊2をそれぞれ2 μg添加し、27℃、32℃、および37℃で3時間インキュベートした。その結果、eIF4Gは27℃または32℃、FLucは27℃、ZsGreenは32℃でタンパク質の発現が最大化された。このことは、本無細胞発現系において、最適な反応温度がタンパク質によって異なることを示唆している。

＊2 Cloning Kit for mRNA Template (BspQ I) (製品コード 6133)、Takara IVTpro T7 mRNA Synthesis Kit (製品コード 6144)、およびCleanCap Reagent AG (3’OMe) (TriLink社) を用いました。

Human Cell-Free Protein Expression Master Mix for mRNA　　　180 μl

－80℃
※本製品は受領後、直ちに－80℃で保管してください。－80℃より高い温度で保管すると性能が低下する場合があります。
※一度に使い切らない場合は、凍結融解による性能低下を避けるため、最初の融解時に小分け分注して保存することをお勧めします。

1. Human Cell-Free Protein Expression Master Mix for mRNAを氷上で融解し、穏やかにピペッティングしてよく混合した後、0.2 mlチューブに18 μlを分注する。
2. 1.を32℃で5分間プレインキュベーションする。
3. 2.にCapped mRNA 2 μg^＊3と必要に応じてNuclease-free waterを加えて、Total 20 μlの反応液を調製する。
4. 反応液を穏やかにピペッティングしてよく混合した後、27～32℃で1～5時間^＊4インキュベーションする。

＊3 Capped mRNA量は2 μgを推奨します。目的タンパク質の産生が少ない場合は、添加量を変更してお試しください。
＊4 最適な反応温度と反応時間は目的タンパク質やmRNA構築物によって異なりますが、初回検討時は32℃で3時間の反応を推奨します。