レンチウイルスベクターによる遺伝子導入細胞のコピー数測定に！
- リアルタイムPCRによる正確なプロウイルスコピー数が定量可能
- 広範なレンチウイルスベクターに対応
- プロウイルスコピー数の定量結果はMOIと相関
製品説明
LVpro Provirus qPCR Quantitation Kitは、プローブ法によるリアルタイムPCRを利用してレンチウイルスベクターによりヒト細胞へ遺伝子導入した際のゲノムに組み込まれたベクターコピー数（プロウイルスコピー数）を測定するための製品です。（図1）本製品は、一般的に広く使われているレンチウイルスベクターで遺伝子導入したヒト正常細胞のプロウイルスコピー数を正確に測定することができます。
図1. LVpro Provirus qPCR Quantitation Kitの操作の流れ
レンチウイルス配列とヒトIFNγ配列の一部がそれぞれ1コピーずつ含まれるProvirus Control Templateを用いて両者の検量線を作成し、目的サンプルのゲノムDNA中のレンチウイルスとヒトIFNγのコピー数（copies/μl）を定量することで、1細胞あたりの平均プロウイルスコピー数を算出する。
図1. LVpro Provirus qPCR Quantitation Kitの操作の流れ
レンチウイルス配列とヒトIFNγ配列の一部がそれぞれ1コピーずつ含まれるProvirus Control Templateを用いて両者の検量線を作成し、目的サンプルのゲノムDNA中のレンチウイルスとヒトIFNγのコピー数（copies/μl）を定量することで、1細胞あたりの平均プロウイルスコピー数を算出する。
使用例
図2. プロウイルスコピー数の測定結果（WGS・他社比較）
レンチウイルスベクタ―で遺伝子導入した細胞（常染色体2倍体細胞）をクローニングし、抽出したゲノムDNAからホールゲノムシーケンス（WGS）でプロウイルスコピー数を確定した。また、それぞれのクローンから抽出したゲノムDNA100 ngを用いて、本製品または他社製品により、プロウイルスコピー数を測定した。本製品とA社製品に関しては独立した3回の試験の平均値を示す。
その結果、本製品によるプロウイルスコピー数と、WGS解析で得られたプロウイルスコピー数はほぼ同等の値を示し、本製品の定量性が非常に正確であることが示唆された。
図3. MOIとプロウイルスコピー数の相関
（左）ZsGreen1遺伝子を搭載したレンチウイルスベクターを段階希釈し、様々なMOI（Multiplicity of Infection）でHT1080細胞に感染させた。
感染から3日後、細胞をDNase I処理後にNucleospin Tissueを用いてゲノムDNAを抽出した。
（右）CD19-CAR遺伝子を搭載したレンチウイルスベクターを段階希釈し、様々なMOIでSUP-T1細胞に感染させた。
感染から3日後、細胞をDNase I処理後にNucleospin Tissueを用いてゲノムDNAを抽出した。
本製品を用いて、各サンプルにつき100 ngのゲノムDNAを使用してリアルタイムPCRを実施した。得られた1細胞当たりの平均プロウイルスコピー数とMOIの相関性を確認した。本データは独立した3回の試験の平均値を示す。
その結果、異なる細胞株・異なる搭載遺伝子の組み合わせにおいて、MOIとプロウイルスコピー数のR2値が0.98を超える高い相関を示した。
内容
| 1．Probe qPCR Mix, with UNG (2×conc.) | 625 μl | ×2 |
| 2．Lentivirus Primer/Probe Mix for Provirus (10×conc.) | 250 μl | |
| 3．hIFNg Primer/Probe Mix for Provirus (10×conc.) | 250 μl | |
| 4．H2O | 1 ml | |
| 5．ROX Reference Dye (50×conc.) | 200 μl | |
| 6．ROX Reference Dye II (50×conc.) | 200 μl | |
| 7．Provirus Control Template (4.13×107 copies/μl) | 25 μl | |
| 8．EASY Dilution (for Real Time PCR) | 1 ml | ×2 |
保存
－20℃
本製品以外に必要な試薬・器具・機器（主なもの）
- 【試薬】
-
- DNA 抽出キット
NucleoSpin Tissue（製品コード740952.10/.50/.250）を推奨 - DNase I＊
Recombinant DNase I (RNase-free)（製品コード 2270A）
＊ レンチウイルスDNA の混入が疑われる場合 - Dulbecco’s phosphate buffered saline (D-PBS)
- DNA 抽出キット
- 【器具】
-
- 200 μl、20 μl、10 μl 各マイクロピペット
- マイクロピペット用チップ（疎水性フィルター付）
- 専用反応チューブあるいはプレート
- 【機器】
-
- 微量高速遠心機
- ヒートブロック（DNase I処理、ゲノムDNA抽出に使用）
- リアルタイムPCR装置
Thermal Cycler Dice Real Time System IV with PC（製品コード TP1010）
Thermal Cycler Dice Real Time System III with PC（製品コード TP970）
※Thermal Cycler Dice Real Time System IIIシリーズの場合は、Filter Unit Premium (HEX/VIC) for LED（製品コード TP704）が必要です。
QuantStudio 5 Real-Time PCR System (96-well, 0.2 mL block)（Thermo Fisher Scientific社）
CFX96 Touch Deep Well Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad社）
LightCycler 96 System（Roche Diagnostics社）
使用上の注意
- 本製品の使用には遺伝子工学と細胞培養に関する基本的な技術が必要です。
- 本製品はレンチウイルスベクターを含むものではなく、また本製品の使用によりレンチウイルスベクターが産生されるものではありません。しかしながら、本製品の使用対象であるレンチウイルスベクターの使用には文部科学省の定める省令（「研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を定める省令」平成16 年文部科学省・環境省令第1号）にあるP2レベル以上の施設が必要です。
- レンチウイルスベクターの系によって生産されるウイルス上清は、挿入断片によっては危険なウイルスを含む恐れがあるため、組換えウイルスの生産と取扱いには、適切な処置をとる必要があります。吸入や付着を防ぐために必ず、安全キャビネットを使用してください。
- 本製品ご利用の際は省令および組織内の組換えDNA実験安全委員会の指示に従い、安全には十分ご注意ください。
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- 注意事項
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