Poly(A) 配列後に余分な配列を持たない“scarless”なmRNA調製に
- in vitro transcription（IVT）にてmRNAを合成する際の鋳型プラスミドを構築するためのベクター
- Type IIS制限酵素BspQ Iで線状化することにより、Poly(A) 配列後に余分な配列を持たない“scarless”な テンプレート調製が可能
- In-Fusion Snap Assembly Master Mix（別売り）と組み合わせることで、簡単・迅速なクローニングが可能
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※本ベクターはIVTでのmRNA合成を意図したプレデザイン済みのIn-Fusionクローニング用プラスミドです。
★In-Fusion Snap Assembly Master Mix（製品コード 638943/638944/638947～638949）を別途ご購入ください。
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製品説明
Template Vector (BspQ I) for T7 mRNA Synthesisは、TriLink社のCapアナログ[CleanCap Reagent AGあるいはCleanCap Reagent AG (3’OMe)] を用いてmRNAを合成する際の鋳型プラスミドを構築するためのベクターです。
予め線状化されたベクター（Linearized Template Vector (BspQ I)）には、T7 promoter、転写開始配列（AGG）、5’-UTR (untranslated region)、 3’-UTR、Poly(A)配列（141塩基）が含まれているため、発現させたい遺伝子のコーディング配列（coding sequence: CDS）をIn-Fusionクローニングするだけで、ヒトやマウスといった哺乳類細胞で使用可能なCleanCap Reagent AGを用いたmRNA合成用の鋳型プラスミドを構築することができます（図1）。
構築したプラスミドは、Poly(A)配列直後に導入したType IIS制限酵素・BspQ Iサイトで線状化することにより、Poly(A)配列後に余分な配列を持たないmRNAの合成鋳型となります（図2）。線状化した鋳型プラスミドからは、Takara IVTpro T7 mRNA Synthesis Kit（製品コード 6144）を用いたin vitro transcription（IVT）により、簡便に目的のmRNAを高収量に調製することが可能です。
鋳型プラスミドの設計やプロトコールの詳細は、本製品のデータシートと合わせてCloning Kit for mRNA Template（製品コード 6143）の取扱説明書をご参照ください。
予め線状化されたベクター（Linearized Template Vector (BspQ I)）には、T7 promoter、転写開始配列（AGG）、5’-UTR (untranslated region)、 3’-UTR、Poly(A)配列（141塩基）が含まれているため、発現させたい遺伝子のコーディング配列（coding sequence: CDS）をIn-Fusionクローニングするだけで、ヒトやマウスといった哺乳類細胞で使用可能なCleanCap Reagent AGを用いたmRNA合成用の鋳型プラスミドを構築することができます（図1）。
構築したプラスミドは、Poly(A)配列直後に導入したType IIS制限酵素・BspQ Iサイトで線状化することにより、Poly(A)配列後に余分な配列を持たないmRNAの合成鋳型となります（図2）。線状化した鋳型プラスミドからは、Takara IVTpro T7 mRNA Synthesis Kit（製品コード 6144）を用いたin vitro transcription（IVT）により、簡便に目的のmRNAを高収量に調製することが可能です。
鋳型プラスミドの設計やプロトコールの詳細は、本製品のデータシートと合わせてCloning Kit for mRNA Template（製品コード 6143）の取扱説明書をご参照ください。
図1．In-FusionクローニングによるIVT鋳型プラスミド構築
図2．Linearized Template Vector (BspQ I) の制限酵素BspQ I切断サイト周辺配列、線状化後の末端構造、およびIVT RNA配列イメージ
Type IIS制限酵素であるBspQ Iの認識配列（赤枠）と切断サイト（青矢印）。切断サイトは認識配列の外側に位置する。
BspQ Iで切断することにより、Poly(A)配列後に余分な配列を持たないmRNAの合成鋳型を作製できる。
用途
Poly(A) 配列後に余分な配列を持たないmRNA合成用鋳型プラスミドの調製
内容
Linearized Template Vector (BspQ I)（50 ng/μl） 10 μl
FLuc Control Fragment (BspQ I)（100 ng/μl） 10 μl
FLuc Control Fragment (BspQ I)（100 ng/μl） 10 μl
配列情報
ZIP形式で圧縮しておりますが、StuffIt Expander等でも解凍できます。
ベクターマップ
NeoR/KanR 53～847
Ori: 1,172～1,760
CMV enhancer: 1,861～2,240
CMV promoter: 2,241～2,444
T7 promoter sequence: 2,489～2,505
Transcription start sequence (AGG): 2,506～2,508
5’UTR: 2,509～2,559
Upstream In-Fusion region (15 bp): 2,545～2,559
▼In-Fusion cloning site (linearized site): between 2,559 and 2,560
Downstream In-Fusion region (15 bp): 2,560～2,574
3’UTR: 2,560～2,672
Poly(A)141 : 2,673～2,813
BspQ I: 2,810
Poly(A) Forward Primer: 2,570～2,589
Poly(A) Reverse Primer: 2,904～2,923
ベクター情報詳細はこちら
Ori: 1,172～1,760
CMV enhancer: 1,861～2,240
CMV promoter: 2,241～2,444
T7 promoter sequence: 2,489～2,505
Transcription start sequence (AGG): 2,506～2,508
5’UTR: 2,509～2,559
Upstream In-Fusion region (15 bp): 2,545～2,559
▼In-Fusion cloning site (linearized site): between 2,559 and 2,560
Downstream In-Fusion region (15 bp): 2,560～2,574
3’UTR: 2,560～2,672
Poly(A)141 : 2,673～2,813
BspQ I: 2,810
Poly(A) Forward Primer: 2,570～2,589
Poly(A) Reverse Primer: 2,904～2,923
ベクター情報詳細はこちら
注意事項
- 鋳型プラスミドの構築には、In-Fusionクローニング試薬が必要です。In-Fusion Snap Assembly Master Mix（製品コード 638943/638944/638947～638949）をご購入ください。
- 鋳型プラスミドの設計やプロトコールの詳細は、本製品のデータシートと合わせてCloning Kit for mRNA Template（製品コード 6143）の取扱説明書をご参照ください。その際に、BspQ Iサイトがクローニングしたい目的遺伝子のCDSに存在しないことを確認してください。BspQ IサイトがCDSに存在する場合は、アミノ酸配列に変化が生じないよう異なるコドン（例：アラニンコドンの“GCU”から“GCC”など）を利用してDNA配列を変更してください。
- 調製する鋳型プラスミドにRNaseが混入した場合、反応後に得られるRNAの収量が低下したり、RNAが断片化します。反応に使用するチューブ、マイクロピペット用チップは専用のものとし、反応を行う際にはディスポーザブル手袋を着用して、RNaseが混入しないようご注意ください。
保存
－20℃
本製品以外に必要な試薬（主なもの）
- In-Fusion Snap Assembly Master Mix（製品コード 638943/638944/638947～638949）
- コンピテントセル
E. coli HST08 Premium Competent Cells（製品コード 9128）など - SOC 培地
- LB（Luria-Bertani）培地
- LB／カナマイシン（50 μg/ml）プレート
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- 注意事項
- 本ページの製品はすべて研究用として販売しております。ヒト、動物への医療、臨床診断用には使用しないようご注意ください。また、食品、化粧品、家庭用品等として使用しないでください。
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