Takara FFPE DNA QC All-in-One Kit

失敗しないNGSのために!FFPE由来DNAの定量と断片化をqPCR法により評価
  • NGSライブラリー調製前にFFPEサンプルの断片化を評価
  • わずか2 ngからの評価で、貴重なサンプルを節約
  • 評価に必要な試薬が全て揃ったオールインワンキット
  • 核酸ダメージ等、FFPEサンプルの品質が気になる方におすすめ
  • ヒトゲノムDNAが対象
製品コード メーカー
略称
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書、CoA
データシート
ベクター情報
参考資料 カート
Takara Code
NN0001

TKR

タカラバイオ(株)
Takara FFPE DNA QC All-in-One Kit
NEW
100回 ¥75,000
説明書・データシート・ベクター情報
NN0001
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製品説明

ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)は長期保存が可能なため臨床および研究分野で生体試料の保存法として広く普及していますが、製作工程で組織固定のために使用するホルマリンが原因でDNAの断片化が生じることがあります。断片化はNGS解析のデータ品質に大きく影響を及ぼすため、FFPEサンプルのNGS解析にあたって、事前の品質評価が重要となります。

Takara FFPE DNA QC All-in-One KitはNGSライブラリー調製前に、リアルタイムPCR法(qPCR)によりFFPE由来DNAの定量と断片化評価を行うキットです。
本製品はヒトのハウスキーピング遺伝子上に長短2つのアンプリコン(PCR産物)用のプライマーを設計しており、それぞれのアンプリコン(Long Assay:268 bp、Short Assay:92 bp)のqPCR増幅効率からFFPEサンプル中のPCR増幅できる有効分子数の定量および断片化評価を行います。NGSライブラリー調製前にDNAの定量と断片化評価を行うことで、下流のライブラリー調製に用いるDNAインプット量の目安を決定でき、ライブラリー調製の成功率向上が期待できます。
本製品はqPCR用Premix、Primer/Probe Mix(FAM)、検量線用DNA Standardなど評価に必要な試薬が全て揃ったオールインワンキットです。

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Takara FFPE DNA QC All-in-One Kitの製品概要・原理

有効分子数の定量:
段階希釈したStandard DNAを用いてPCRを行い、得られたCt値をy軸に、Standard DNAのコピー数の対数値をx軸にプロットして検量線を作成します。この検量線をもとに、目的サンプルのShort Assayのアンプリコン増幅から有効分子数を定量します。

断片化評価:
断片化が進んだFFPE由来DNAはLong Assayアンプリコンの増幅が低下することから、Long/Shortアンプリコンの定量値の比率を以下の式で求め、FFPE由来DNAの断片化評価を行います。

Long/Short比=Long Assayの定量値/Short Assayの定量値

Long/Short比は0~1の範囲で評価され、断片化していないサンプルはLong/Short比の値が1.0となり、断片化が進むにつれてその値は小さくなります。

※本製品は検量線作成分も含めて100回分の試薬が入っています。N=2で実験を行う場合、評価可能サンプル数は最大42サンプルです。以下に96 well plateへの分注例を示します。
<Short AssayとLong Assayで96 well plateを1枚ずつ使用する場合>
Short AssayとLong Assayで96 well plateを1枚ずつ使用する場合
※Long Assayも同様
<Short AssayとLong Assayを1 plateで行う場合>
Short AssayとLong Assayを1 plateで行う場合

異なるサイズの断片化DNAサンプルを用いたqPCRデータ
異なるサイズの断片化DNAサンプルを用いたqPCRデータによる品質評価
M:Marker
1 :Whole Genome
2 :Frag_1
3 :Frag_2
4 :Frag_3
5 :Frag_4
6 :Frag_5
7 :Frag_6
図1. 異なるサイズの断片化DNAサンプルを用いたqPCRデータによる品質評価
物理的にせん断したゲノムDNAの断片化度合いを、電気泳動により確認した(レーン:2~7)。断片化したDNAサンプルをテンプレートとして、Takara FFPE DNA QC All-in-One Kitを用いて断片化評価(Long/Short比)を行った。
Long/Short比は、断片化していないDNAでは1に近い値を示し、サンプルの断片化度合いを反映した値を示す結果となった。


FFPE由来DNAをテンプレートとした時のFFPE品質検定qPCRおよびライブラリー調製結果
M:Marker
1:Colon_1
2:Lymph nodes
3:Adipose Tissue
4:Colon_2
5:Kidney
6:Liver
7:Pancreas
FFPE由来DNAをテンプレートとした時のFFPE品質検定qPCRおよびライブラリー調製結果
図2. FFPE由来DNAをテンプレートとした時のFFPE品質検定qPCRおよびライブラリー調製結果
7種類のFFPE由来DNAの断片化状態を電気泳動で評価し、Takara FFPE DNA QC All-in-One Kitにより品質検定を行った(A)。また、ThruPLEX Tag-Seq HV(ライブラリー調製キット:製品コード R400742)を用いて同サンプルのライブラリーを調製し、各DNAサンプルより得られたLibrary収量と断片化率(“Long/Short比”)をプロットした結果、Long/Short比とライブラリー収量に相関((r)=0.95)を認めた(B)。Long/Short比の異なる2種類のFFPE由来DNA(0.16、0.02)を用いて、2段階のインプット濃度(10 ng、100 ng)でライブラリーを調製したところ、Long/Short比の低いFFPE由来DNAでも100 ngにインプット量を増やすことでライブラリー収量が増大することを確認した(C)。

内容

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2X Premix FFPE QC*11 ml×2
Short Assay Primer/Probe Mix*210×200 μl
Long Assay Primer/Probe Mix*210×200 μl
H2O RNase Free H2O1 ml×2
DNA Standard FFPE QC3.3×105 copies/μl100 μl
EASY Dilution (for Real Time PCR)1 ml×2
ROX Reference Dye II*350×100 μl

*1 酵素、基質等を含みます。
*2 蛍光標識プローブを含んでいるため、遮光に留意してください。
*3 蛍光物質を含んでいるため、遮光に留意してください。
  ウェル間の蛍光シグナルの補正を行う装置で解析する場合に必要です。
  • ROX Reference Dye IIを添加する機種
    • QuantStudio 5 Real-Time PCR System (96-well, 0.1または0.2 ml block) (Thermo Fisher Scientific社)

  • 添加の必要がない機種
    • Thermal Cycler Dice Real Time System IV(製品コード TP1000/TP1010/TP1030)
    • Thermal Cycler Dice Real Time System III(製品コード TP950/TP970/TP980/TP990)
    • CronoSTAR 96 Real-Time PCR System(製品コード 640231/640232)
    • CFX96 Touch Deep Well Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad社)
    • LightCycler 96 System/LightCycler 480 System II(Roche Diagnostics社)

保存

-20℃

本製品以外に必要な器具、機器(主なもの)

【 器具 】
  • マイクロピペット
  • マイクロピペット用チップ(疎水性フィルター付き)
  • リアルタイムPCR用のチューブ等
【 機器 】
  • FAMを検出可能なリアルタイムPCR装置(以下の装置で使用可能なことを確認済み)
    • Thermal Cycler Dice Real Time System IV(製品コード TP1000/TP1010/TP1030)
    • Thermal Cycler Dice Real Time System III(製品コード TP950/TP970/TP980/TP990)
    • CronoSTAR 96 Real-Time PCR System(製品コード 640231/640232)
    • CFX96 Touch Deep Well Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad社)
    • LightCycler 96 System/LightCycler 480 System II(Roche Diagnostics社)
    • QuantStudio 5 Real-Time PCR System(96-well, 0.1または0.2 ml block)(Thermo Fisher Scientific社)
注意事項
  • 本ページの製品はすべて研究用として販売しております。ヒト、動物への医療、臨床診断用には使用しないようご注意ください。また、食品、化粧品、家庭用品等として使用しないでください。
  • タカラバイオの承認を得ずに製品の再販・譲渡、再販・譲渡のための改変、商用製品の製造に使用することは禁止されています。
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    また、他メーカーの製品に関するライセンス・パテントについては、各メーカーのウェブサイトまたはメーカー発行のカタログ等でご確認ください。
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