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Vaccinia Capping Enzyme (10 U/μl) | 500 U |
10× Capping Buffer | 100 μl |
S-adenosylmethionine (SAM) (32 mM) | 100 µl |
GTP (10 mM) | 50 µl |
1× | Capping Buffer | |
1 μM | GTP | |
10 μCi/ml | [α-32P]GTP | |
0.67 mM | SAM | |
2.5 μg/50 μl | 100 nt RNA |
Denatured RNA transcript (10 μg)*1、4 | 15 μl | |
10× Capping Buffer | 2 μl | |
GTP (10 mM) | 1 μl | |
SAM (2 mM, dilute 32 mM stock to 2 mM)*2 | 1 μl | |
Vaccinia Capping Enzyme (10 U/μl) | 1 μl | |
Total | 20 μl | *3 |
Denatured RNA transcript (10 μg)*1、4 | 14 μl | |
10× Capping Buffer | 2 μl | |
GTP (10 mM) | 1 μl | |
SAM (4 mM, dilute 32 mM stock to 4 mM)*2 | 1 μl | |
Vaccinia Capping Enzyme (10 U/μl) | 1 μl | |
mRNA Cap 2’-O-Methyltransferase (50 U/μl) | 1 μl | |
Total | 20 μl | *3 |
*1 | 使用するRNA(5’-triphosphate RNA)は5’末端が複雑な2次構造を取る場合に備え、反応前に熱変性する。 <熱変性>
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*2 | SAMは不安定であるため、反応前に必要分を32 mMのストック溶液からRNase-free waterで希釈調製する。希釈液は反応まで氷上で保存する。 | ||||
*3 | 必要に応じてスケールアップ可能。 | ||||
*4 | RNAの長さが200 nt以下である場合は、cap付加効率(およびメチル化効率)を上げるため反応時間を延長する(Cap-0 RNA調製:30分→1時間、Cap-1 RNA調製:1時間→2時間)。 |
注: | 反応液中のRNAを安定的に保つため、RNase inhibitorが使用できます。使用する場合は、最終濃度が1 U/μlとなるように添加してください。 |
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