PrimeSTAR^® Max DNA Polymerase Ver.2

PrimeSTAR Max DNA Polymerase Ver.2は、世界最高レベルの正確性と伸長速度を有するPCR酵素です。迅速かつエラーの無い複製に寄与する促進因子を添加し、あわせて反応液組成を最適化することで、従来品PrimeSTAR Max DNA Polymerase（製品コード R045A/B）の高い正確性を維持しながら、高速反応での増幅成功率が向上しました。本酵素は従来品と置き換えが可能で、かつ従来品以上の性能を有しています。
本酵素は常温下でのDNA Polymerase活性および3’→5’exonuclease活性を抑えるモノクローナル抗体を用いたホットスタート用酵素であり、反応コンポーネントがプレミックス化されているため、常温で迅速に反応液を調製できます。

【特長】

• 非常に高い正確性：Taqの約420倍（※弊社比）
• 世界トップクラスの伸長速度：5 sec./kb
• 鋳型許容量の改善／PCR産物の収量が向上（※従来品との比較）

R047A（100回、50 μl反応系）
PrimeSTAR Max Ver.2 Premix (2×)　625 μl×4

R047S（25回、50 μl反応系）
PrimeSTAR Max Ver.2 Premix (2×)　625 μl

－20℃

注）使用前には激しい攪拌を避け、転倒混和後スピンダウンしてください。過剰に凍結融解を繰り返すと本製品に含まれる酵素の活性が低下する場合があります。

※PCR反応液の調製は室温でも可能です。ただし、酵素などの各試薬は氷上に置いてご使用ください。

	使用量	最終濃度
PrimeSTAR Max Ver.2 Premix (2×)	25 μl	1×
Primer1	10～15 pmol	0.2～0.3 μM
Primer2	10～15 pmol	0.2～0.3 μM
Template	推奨鋳型量を参照
滅菌精製水	up to 50 μl

【推奨鋳型量】

ヒトゲノムDNA	5～500 ng
大腸菌ゲノムDNA	100 pg～200 ng
プラスミドDNA	10 pg～10 ng
逆転写産物（cDNA）	total RNA 10～1,000 ng相当

※バイサルファイト処理したDNAなどのウラシルを含む鋳型は使用できません。

PrimeSTAR Max DNA Polymerase Ver.2を用いたPCR反応では、伸長因子の効果を最大限発揮させるために3ステップでの反応を推奨します。
なお、GC richな鋳型や長鎖などの特異性が要求される増幅には、2ステップでの反応を推奨します。

98℃＊1	10 sec.		30～35 cycle
55℃	5 or 15 sec.＊2
68℃＊3	5～10 sec./kb＊4

もしくは

98℃＊1	10 sec.		30～35 cycle
68℃＊3	5～10 sec./kb＊4

＊1 変性条件
98℃、5～10 sec.を推奨する。94℃で行う場合は10～15 sec.に設定する。

＊2 アニーリング時間
Tm値が55℃以上の場合は、5 sec.に設定する。Tm値が55℃未満の場合は、15 sec.に設定する。
【重要】本酵素はプライミング効率が非常に高い酵素ですので、アニーリング時間が長くなると、スメアが生じる場合があります。

※Tm値の計算方法
Tm 値 （℃）＝ 2（NA＋NT）＋4（NC＋NG）-5
プライマーの長さが25 mer以下の場合に適用する。25 merを超える場合は、アニーリング時間を5 sec.に設定する。

＊3 伸長温度
3 step PCR、2 step PCRともに68℃に設定する。

＊4 伸長時間（目安）
増幅鎖長 ≦ 6 kb：5 sec./kb（鋳型がcDNAの場合は10 sec./kb）
増幅鎖長 ＞ 6 kb：10 sec./kb（鋳型がcDNAの場合は20 sec./kb）
伸長時間を長くすることで増幅量を増やせる場合がある。

• ゲノムDNAの鋳型量が500 ngを超える場合
  →伸長時間を10 sec./kbに設定する。

  98℃	10 sec.		30～35 cycle
  55℃	5 or 15 sec.
  68℃	5～10 sec./kb

  
  もしくは

  98℃	10 sec.		30～35 cycle
  68℃	5～10 sec./kb

  

  

  伸長時間を
  10 sec./kbに設定する


• cDNAを鋳型として、増幅量が少ない場合
  →プライマーの濃度を上げると改善する場合があります。
  
  一般的なPCR反応液量（Total 50 μl）
  PrimeSTAR Max Ver.2 Premix (2×) 25 μl
  Primer 1　　10～15 pmol
  （final conc. 0.2～0.3 μM）
  Primer 2　　10～15 pmol
  （final conc. 0.2～0.3 μM）
  Template
  滅菌精製水　　up to 50 μl

  

  

  プライマー濃度を
  Final conc. 0.3～0.5 Mに上げる

PrimeSTAR Max DNA Polymerase Ver.2を用いて増幅したPCR産物のほとんどは平滑末端になっています。したがって、PCR産物をそのまま（必要に応じてリン酸化を行って）平滑末端のベクターにクローニングすることが可能です。平滑末端ベクターへのクローニングにはMighty Cloning Reagent Set (Blunt End)（製品コード 6027）の使用を推奨します。
T-vector にクローニングしたい場合には、3’末端へのdA付加反応を行う必要があるため、Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR（製品コード 6019）の使用を推奨します。また、In-Fusion クローニングも利用できます。In-Fusion反応の詳細は、In-Fusion Snap Assembly Master Mix（製品コード 638947/638948/638949ほか）などの製品ページをご参照ください。

【制限酵素処理を行う場合】
増幅産物を制限酵素処理する場合は、フェノール／クロロホルム処理、またはNucleoSpin Gel and PCR Clean-up（製品コード 740609.10/.50/.250）などを用いてタンパク質除去操作を行ってください。特に3’-突出型の制限酵素（例えばPst Iなど）の場合、本酵素の3’→5’exonuclease活性が残存していると、制限酵素処理中に3’-突出末端が削られることがあります。

【ダイレクトシーケンスを行う場合】
本酵素は3’→5’ exonuclease活性を有するため、ダイレクトシーケンスを行う前にフェノール／クロロホルム処理、またはNucleoSpin Gel and PCR Clean-upなどを用いたタンパク質除去操作を推奨します。

PrimeSTAR Max DNA Polymerase Ver.2を用いて増幅したPCR産物を電気泳動する場合は、TAE Bufferの使用を推奨します。TBE Bufferを使用すると、泳動パターンがやや裾広がりになり、きれいな泳動結果が得られない場合があります。