TransIT-VirusGEN Transfection Reagent(reagent:DNA(vol:wt)=2:1)、A社製品1、A社製品2、25 kDaポリエチレンイミン(PEI)を用いて、浮遊培養したFreeStyle 293-F細胞(FreeStyle F17 Mediumで培養)(A)、または接着培養した293T/17細胞 (B)にpAAV-hrGFP、pAAV-RC、pAAV-Helper (1:1:1 ratio, 1.5 μg/ml, Agilent Technologies)をトランスフェクションした。抽出したウイルスをHT1080細胞に感染させ、48時間後にGFPの発現をフローサイトメーターにより測定した。
Functional titerはGFP陽性細胞が20%未満となるウイルス希釈率より求めた。エラーバーは3ウェルの標準偏差を示す。
TransIT-VirusGEN Transfection Reagent(reagent:DNA(vol:wt)=3:1)、A社製品1、A社製品2、25 kDaポリエチレンイミン(PEI)を用いて、浮遊培養したFreeStyle 293-F細胞(FreeStyle F17 Mediumで培養)(A)、または接着培養した293T/17細胞 (B)にpLKO.1-puro-CMV-TurboGFP transfer vector、MISSION Lentivirus Packaging Mix(1:1 ratio, 1 μg/ml)をトランスフェクションした。培養上清を0.45 μmフィルターで濾過後、8 μg/ml TransduceIT存在下で293T/17に感染させ、72時間後にGFPの発現をフローサイトメーターにより測定した。
Functional titerはGFP陽性細胞が20%未満となるウイルス希釈率より求めた。エラーバーは3ウェルの標準偏差を示す。
異なる培養容器、培養液量で浮遊培養したFreeStyle 293-F細胞(FreeStyle F17 Mediumで培養)(A)、または接着培養した293T/17細胞 (B)に、TransIT-VirusGEN Transfection Reagentを用いてpAAV-hrGFP、pAAV-RC、pAAV-Helper (1:1:1 ratio, 1.5 μg/ml, Agilent Technologies)をトランスフェクションした(reagent:DNA(vol:wt)=2:1)。抽出したウイルスをHT1080細胞に感染させ、48時間後にGFPの発現をフローサイトメーターにより測定した。
Functional titerはGFP陽性細胞が20%未満となるウイルス希釈率より求めた。エラーバーは3ウェル/フラスコ/ディッシュの標準偏差を示す。
TransIT-ViruGEN Transfection Reagent 、VirusGEN AAV Transfection Kit、A社製品1、A社製品3を用いて組み換えAAV2の産生能を比較した。Expi293 Expression Media(Thermo Fisher Scientific)で培養したExpi293F cells (Thermo Fisher Scientific)に対して、pAAV-hrGFP, pAAV-RC and pAAV-Helper plasmids(1:1:1 DNA ratio, 2 μg/ml-2 mg per flask, Agilent Technologies)を遺伝子導入し、72時間後、化学的に細胞を溶解してウイルスを回収した。
A.回収したウイルスをHT10180細胞に感染させ、48時間後にGFPの発現を指標にタイターを測定した。また導入されたコピー数についてはCMVプロモーター領域をddPCRで解析して測定した。
B.作製されたウイルスのcapsid数はAAV2 Titration ELISA Kit(Progen)を用いて測定した。また、GC/capsidの比率を計算して算出した。
TransIT-ViruGEN Transfection Reagent、VirusGEN LV Transfection Kit、A社製品3、C社製品1を用いて組み換えLVの産生能を比較した。Expi293 Expression Media (Thermo Fisher Scientific) で培養したExpi293F cells(Thermo Fisher Scientific)に対して、2組のプラスミドセット(A. pALD-LentiEGFP-A transfer vector、pALD-VSV-G-A、pALD-Rev-Aと pALD-GagPol-A packaging vectors(DNA比率3:0.5:0.5:2 , Aldevron)、B. pLKO.1-puro-CMV-TurboGFP transfer vector(MilliporeSigma)、ViraSafe Pantropic Packaging mix(pRSV-Rev, pCMV-VSV-G, pCgpV, CellBio Lab)、DNA比率3:0.5:0.5:2 )を遺伝子導入し、ウイルスを回収した。
回収したウイルスを293T/17細胞に感染させ、72時間後にGFPの発現を指標にタイターを測定した。
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