TransIT-VirusGEN^® Transfection Reagent

TransIT-VirusGEN Transfection Reagent（reagent：DNA(vol：wt)＝2：1）、A社製品1、A社製品2、25 kDaポリエチレンイミン(PEI)を用いて、浮遊培養したFreeStyle 293-F細胞（FreeStyle F17 Mediumで培養）(A)、または接着培養した293T/17細胞 (B)にpAAV-hrGFP、pAAV-RC、pAAV-Helper (1：1：1 ratio, 1.5 μg/ml, Agilent Technologies)をトランスフェクションした。抽出したウイルスをHT1080細胞に感染させ、48時間後にGFPの発現をフローサイトメーターにより測定した。
Functional titerはGFP陽性細胞が20％未満となるウイルス希釈率より求めた。エラーバーは3ウェルの標準偏差を示す。

TransIT-VirusGEN Transfection Reagent（reagent：DNA(vol：wt)＝3：1）、A社製品1、A社製品2、25 kDaポリエチレンイミン(PEI)を用いて、浮遊培養したFreeStyle 293-F細胞（FreeStyle F17 Mediumで培養）(A)、または接着培養した293T/17細胞 (B)にpLKO.1-puro-CMV-TurboGFP transfer vector、MISSION Lentivirus Packaging Mix（1：1 ratio, 1 μg/ml）をトランスフェクションした。培養上清を0.45 μmフィルターで濾過後、8 μg/ml TransduceIT存在下で293T/17に感染させ、72時間後にGFPの発現をフローサイトメーターにより測定した。
Functional titerはGFP陽性細胞が20％未満となるウイルス希釈率より求めた。エラーバーは3ウェルの標準偏差を示す。

異なる培養容器、培養液量で浮遊培養したFreeStyle 293-F細胞（FreeStyle F17 Mediumで培養）(A)、または接着培養した293T/17細胞 (B)に、TransIT-VirusGEN Transfection Reagentを用いてpAAV-hrGFP、pAAV-RC、pAAV-Helper (1：1：1 ratio, 1.5 μg/ml, Agilent Technologies)をトランスフェクションした（reagent：DNA(vol：wt)＝2：1）。抽出したウイルスをHT1080細胞に感染させ、48時間後にGFPの発現をフローサイトメーターにより測定した。
Functional titerはGFP陽性細胞が20％未満となるウイルス希釈率より求めた。エラーバーは3ウェル/フラスコ/ディッシュの標準偏差を示す。

TransIT-ViruGEN Transfection Reagent 、VirusGEN AAV Transfection Kit、A社製品1、A社製品3を用いて組み換えAAV2の産生能を比較した。Expi293 Expression Media（Thermo Fisher Scientific）で培養したExpi293F cells （Thermo Fisher Scientific）に対して、pAAV-hrGFP, pAAV-RC and pAAV-Helper plasmids（1:1:1 DNA ratio, 2 μg/ml-2 mg per flask, Agilent Technologies）を遺伝子導入し、72時間後、化学的に細胞を溶解してウイルスを回収した。
A.回収したウイルスをHT10180細胞に感染させ、48時間後にGFPの発現を指標にタイターを測定した。また導入されたコピー数についてはCMVプロモーター領域をddPCRで解析して測定した。
B.作製されたウイルスのcapsid数はAAV2 Titration ELISA Kit（Progen）を用いて測定した。また、GC/capsidの比率を計算して算出した。

TransIT-ViruGEN Transfection Reagent、VirusGEN LV Transfection Kit、A社製品3、C社製品1を用いて組み換えLVの産生能を比較した。Expi293 Expression Media （Thermo Fisher Scientific） で培養したExpi293F cells（Thermo Fisher Scientific）に対して、2組のプラスミドセット（A. pALD-LentiEGFP-A transfer vector、pALD-VSV-G-A、pALD-Rev-Aと pALD-GagPol-A packaging vectors（DNA比率3:0.5:0.5:2 , Aldevron）、B. pLKO.1-puro-CMV-TurboGFP transfer vector（MilliporeSigma）、ViraSafe Pantropic Packaging mix（pRSV-Rev, pCMV-VSV-G, pCgpV, CellBio Lab）、DNA比率3:0.5:0.5:2 ）を遺伝子導入し、ウイルスを回収した。
回収したウイルスを293T/17細胞に感染させ、72時間後にGFPの発現を指標にタイターを測定した。