トランスジーンの挿入位置同定

PacBioロングリードシーケンサー（パシフィックバイオサイエンス社）を用いた解析により、挿入位置だけでなく繰り返し配列の多い複雑な挿入パターンや挿入配列を解析します。また、ショートリードシーケンサーNovaSeqシステム（イルミナ社）を用いた挿入位置のみの特定も可能です。

＜トランスジーンの挿入位置同定　ロングリード＞
20 kb程度に断片化したゲノムDNAからライブラリーを調製し、PacBioロングリードシーケンサーを用いて全ゲノムシーケンスを行います。取得したデータは挿入配列へマッピングし、そのマッピングされたリードをホストゲノム配列＋挿入配列にマッピングします。次に、ホストゲノム配列および挿入配列にスプリットされたリードを抽出し、挿入位置特定および挿入位置周辺のコンセンサス配列作成を行います。挿入領域全長が20 kb以下の場合は、全長配列取得、コピー数同定あるいは配列の挿入パターン評価が可能です。挿入領域長が20 kbを超える場合は別途ご相談ください。

• ブレイクポイントの検出結果例
  挿入領域の特定を行うため、挿入配列に対してマッピングを行い、挿入配列を含むリードの抽出を行います。抽出された「挿入領域にマップされたリード」を用いて「参照配列＋挿入配列」に対するマッピングを行い、ブレイクポイントを検出します。
  
  
  
• コンセンサス配列へのマッピング例
  検出されたブレイクポイントごとに参照配列と挿入配列をまたぐ形でマップされたリードを分類し、ブレイクポイント付近のコンセンサス配列を構築後、挿入配列、およびブレイクポイントで分割したリファレンス配列をマッピングします。
  

＜トランスジーンの挿入位置同定　ショートリード＞
300～600 bp程度にランダムに断片化したゲノムDNAからライブラリーを調製し、NovaSeqシーケンサー（イルミナ社）を用いて全ゲノムシーケンスを実施いたします。取得したデータは挿入配列と参照ゲノム配列へマッピングし、両方にマッピングされたリード情報（Discordant reads [d]）およびブレイクポイントをまたぐリード情報（Split reads [s]）から挿入位置を検出、挿入位置の情報を納品いたします。

• トランスジーン挿入図
  


• 検出可能なトランスジーン挿入情報
  

  	ショートリード	ロングリード
  ブレイクポイント検出	〇	〇
  挿入配列構築、パターン特定	×	〇*

  * 挿入領域長20 kbを超える場合は挿入位置付近のみの配列構築、パターン特定となります。

ご依頼の内容により異なりますので、お問い合わせください。

お見積りについてはこちらよりご依頼ください。

• 作業報告書
• シーケンスデータ一式
• マッピング結果
• ブレイクポイントの検出結果
• コンセンサス配列（ロングリードの場合のみ）

オンライン注文とメール注文の2種類からお選びください。

• オンライン注文
  WEB会員登録後、必要事項を入力してご注文ください。オンライン注文へ
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  ※ 生物種、サンプル形態によっては対応していないものがございます。その場合は見積書をご用意の上、ご依頼方法をご案内いたしますので、お問い合わせください。
  ご注文方法の概略については、「オンラインのご注文方法について」をご参照ください。
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• メール注文
  ・サンプル送付の前に、以下のフォーマットに必要事項をご記入の上、電子メールにてこちらへご送付ください。
  ・依頼書記載のサンプル名称と、実際の送付サンプルに記載の名称は必ず一致させてください。
  ※WEB会員にログインした状態で依頼書をダウンロードいただくと、WEB会員登録情報が依頼書に反映されます。
  
  • 次世代シーケンス（NGS）解析発注依頼書（Excel）
  • ヒトゲノム・遺伝子解析情報提供用紙（Excel）
    ※弊社「個人情報としてのゲノムデータの取り扱い」の詳細はこちらをご参照ください。
  • 臨床検体又は供与細胞に関する情報提供用紙（Excel）
    ※臨床検体・細胞を送付いただく場合は、受託サービスをお申込みいただく前に、「臨床検体又は供与細胞に関する情報提供用紙」にご記入の上、弊社へお送りください。弊社にてご提供いただいた情報を元にお取り扱いの可否を判断して折り返しご連絡いたします。
    「臨床検体のお取り扱いについて」の詳細はこちらをご参照ください。


• サンプル送付
  ・解析サンプルならびに依頼書（オンライン注文の場合は注文依頼完了画面の印刷物）を下記サンプル送付先へご送付ください。
  ・サンプルは乾燥・漏れならびに容器破損が無いようにご注意いただき、平日午前着指定でご送付ください。また遠隔地を除き、翌日必着でご送付ください。
  ・送付サンプルがDNAの場合には、ロングリード用サンプルは保冷剤梱包の冷蔵便（4℃）で、ショートリード用サンプルは－20℃の状態の冷凍便でお送りください。

• 参照ゲノム配列や挿入遺伝子配列および導⼊⽅法の情報
• ゲノムDNA
  できる限り、ホモ個体より得られたサンプルをご用意ください。
  以下の点にご注意の上、解析サンプルを調製してください。
  

  	サンプル量	濃度	液量（目安）	純度
  				OD260/OD280	OD260/OD230
  ロングリード	13 μg以上	50 ng/μl以上	100 μl以上	1.6以上
  ショートリード	4 μg以上	80 ng/μl以上	50 μl以上	1.6以上

  
  

  ・	DNAは滅菌水もしくはReduced EDTA TE buffer：10 mM Tris-HCl、0.1 mM EDTA pH8.0に溶解してください。
  ・	ロングリードでの解析の場合、DNA抽出はフェノール／クロロフォルム法または長鎖DNA抽出用キットを使用してください。抽出後は凍結せず冷蔵（4℃）で、できるだけ早くサンプルをご送付ください。上記基準に満たない場合は別途お問い合わせください。
  ・	電気泳動（1％ゲル）にて10～20 kb以上に明確なバンドが検出され、低分⼦の混⼊および分解がないことをご確認ください。ロングリードでの解析の場合は、パルスフィールドゲルまたは0.3％アガロースゲル電気泳動で50 kb以上に明確なバンドが検出され、低分子の混入および分解がないことをご確認ください。
  ・	上記基準に満たない場合は別途お問い合わせください。

■サンプル送付容器について
・ゲノムDNAサンプルは1.5 mlチューブでご提供ください。0.2 ml、0.5 ml、8連チューブでのご提供はご遠慮ください。
　＊24検体以上の場合は96 well plateでご提供ください。プレートで送付いただけない場合は、納期が延びる場合がございます。
※プレートは弊社より提供可能（無償）です。ご希望の方はお問い合わせください。

＜推奨プレートおよびシール＞
・Eppendorf twin.tec full-skirted 96-well PCR plates（Eppendorf社, No. EP-0030128.648）
・タイタースティックHCフィルム（WATSON社, No. 547-KTS-HC）