TaKaRa Ex Premier™ DNA Polymerase

TaKaRa Ex Premier DNA Polymeraseは、Thermococcus属古細菌由来の DNA Polymeraseをベースに開発したα型新規PCR酵素である。
本製品は、酵素とバッファーの至適化により一般的なPCR試薬では増幅が困難な難増幅配列（GC/ATリッチ配列）や長鎖のターゲット、クルードサンプルに対するPCR増幅の成功率が向上している。さらに、優れた校正機能を有するα型ポリメラーゼ特有の高い正確性も保持しており、特異性の高いPCR増幅結果が得られるため、クローニングにも使用できる。
本製品は、全てのコンポーネント（酵素、バッファー、dNTP Mixture等）が含まれている2×プレミックスタイプであり、－20℃で凍結しないため融解の手間がなく、直ちにプライマーと鋳型を加えてPCRを行うことができる。
また、Dye入り製品（製品コード RR371S/A/B）は、電気泳動時に便利な色素マーカー（緑色：青色と黄色の混合色素）が添加されており、PCR反応後の電気泳動の際に直接ゲルへのアプライが可能である。
本製品に含まれる酵素は常温下でのDNA Polymerase活性および3’→5’exonuclease活性を抑えるモノクローナル抗体を添加したホットスタート用PCR酵素である。

なお、本製品を用いて増幅したPCR産物のほとんどは、酵素の校正活性により平滑末端になっている。したがって、そのままTAクローニングはできない。クローニングする場合は、In-Fusionクローニングもしくは平滑末端ベクターへのクローニングを推奨する。平滑末端ベクターへのクローニングにはMighty Cloning Reagent Set (Blunt End)（製品コード 6027）の使用を推奨する。T-vectorにクローニングしたい場合は3’末端へのdA付加反応を行う必要があり、Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR（製品コード 6019）の使用を推奨する。

【補足：In-Fusionシステムを利用するクローニング方法】
本製品はIn-Fusionクローニングシステムと組み合わせて使用することができ、PCR断片を短時間で効率良く任意のベクターにクローニングすることが可能である。
In-FusionクローニングにはIn-Fusion Snap Assembly Master Mix（製品コード 638947他）などのシリーズ製品を使用することができる（関連情報もしくはデータシート参照）。

－20℃
※注意事項：
使用前には激しい攪拌を避け、転倒混和後スピンダウンしてください。

PCR法によるDNA増幅
特に以下のPCR増幅に推奨：

• GC-rich、AT-richなど通常酵素では増幅困難な鋳型からの増幅
• 10 kb以上の長鎖DNAの増幅
• マウステールなどの動物組織、植物組織、血液検体など、クルードサンプルからの増幅
• 核酸を多く含むcDNAからの増幅
• クローニングを目的とした目的遺伝子やベクターの増幅

cDNA合成反応液の成分により、PCR反応液が凝集する場合がある。
cDNA合成にはPrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit（製品コード 6210A/B）、PrimeScript IV 1st strand cDNA Synthesis Mix（製品コード 6215A/B）を推奨する。

94℃	1 min.＊1
98℃ 55～60℃ 68℃	10 sec. 15 sec. 30 sec./kb＊2		30 cycles

ただし、GC/ATリッチな鋳型や10 kb以上の長鎖の増幅には2 step PCRを推奨

94℃	1 min.＊1
98℃ 68℃	10 sec. 30 sec./kb＊2		30 cycles

注1）イノシンを含むプライマーの使用は避ける
注2）アニーリング温度はプライマーのTm値に合わせて設定する。

＊1　GC/ATリッチ領域や長鎖ターゲットの増幅を行う場合には、94℃ 1分で初期変性を行うことを推奨する。
＊2　クルードサンプルから増幅する場合は伸長時間を1 min./kbに設定することを推奨する。

マウスの様々な組織（尾、脳、EDTA血液）からの粗抽出液を鋳型とし、TaKaRa Ex Premier（製品コード RR370S/A/B）およびTaKaRa Ex Premier Dye plus（製品コード RR371S/A/B）を用いてPCRを行った。
※抽出液の調製にはLysis Buffer for PCR（製品コード 9170A）を使用した。

（参考）抽出液の調製方法

＊3	本製品はLysis Buffer for PCR（製品コード 9170A）に含まれます。
＊4	保存する場合は、上清を別のチューブに移して－20℃以下で保存してください。 PCRに使用する前には室温に戻し、沈殿物がないことを確認してください。

各組織抽出液において、ターゲット遺伝子の特異的な増幅を確認することができました。