二本鎖cDNA合成
製品説明
本キットは、主に動植物由来のpolyA＋ RNA より、二本鎖cDNAを合成するためのキットである。
本キットの構築はGubler-Hoffman の方法1）に基づいている。システム原理を以下に示す（図1、2参照）。
本キットの構築はGubler-Hoffman の方法1）に基づいている。システム原理を以下に示す（図1、2参照）。
- PrimeScript RTase とOligo (dT)18 PrimerあるいはRandom Primerを用いて1st strand cDNAを合成する。
- E. coli RNase Hで、mRNA-cDNAハイブリッド中のRNAにニックを入れて、E. coli DNA Polymerase I とE. coli DNA Ligaseのシステムにより、RNA鎖をDNA鎖に置き換えていき、2nd strand DNAを合成する。
- T4 DNA Polymeraseにより、末端の平滑化を行う。
内容
（10回）
| PrimeScript RTase（200 U/μl） | 10 μl |
| RNase Inhibitor（40 U/μl） | 10 μl |
| Oligo (dT)18 Primer（1 μg/μl） | 20 μl |
| Random Primer（9 mer）（0.3 μg/μl） | 20 μl |
| 5×1st Strand Synthesis Buffer | 40 μl |
| dNTP Mixture（各10 mM） | 40 μl |
| E. coli RNase H / E. coli DNA Ligase Mixture | 20 μl |
| E. coli DNA Polymerase I（20 U/μl） | 20 μl |
| 5×2nd Strand Synthesis Buffer | 300 μl |
| T4 DNA Polymerase（1 U/μl） | 40 μl |
| RNase free dH2O | 600 μl×2 |
| Control RNA（1 μg/μl）＊ | 5 μl |
| ＊ | 本キットに添付されているControl RNAは、SP6 promoter領域の下流にpBR322由来のテトラサイクリン耐性遺伝子を含む約1.4 kbの断片を挿入したプラスミドpSP Tet3を鋳型にして、SP6 RNA Polymeraseを用いてin vitro transcriptionにより合成したものである。このControl RNAは、30個のアデニン塩基よりなるpolyA tailを持つ鎖長約1.4 kbのpolyA＋ RNAで、このRNAを鋳型に二本鎖cDNAを合成して、適切なプラスミドに挿入した際この二本鎖cDNAがfull-lengthのものであれば、このプラスミドはテトラサイクリン耐性になる。 |
保存
－20℃
cDNA合成の原理
図1．Oligo (dT)18 Primerを用いた二本鎖cDNA合成反応
図2．Random Primerを用いた二本鎖cDNA合成反応
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