In-Fusion^® Snap Assembly Master Mix

In-Fusion Snap Assembly Master Mixは、わずか15分間の反応で、1個～複数のPCR断片を任意のベクターの任意のサイトへ設計通りにクローニングできるキットである。クローニングするPCR断片に対し、制限酵素処理、リン酸化、平滑末端化は不要である。クローニング効率が95％以上であるため、ハイスループットなどのスケールアップも可能である。
In-Fusion反応では、PCR断片と線状化ベクターの両末端15塩基の相同配列を利用して効率よくクローニングする。この15塩基の相同配列はPCR用プライマーの設計により容易に付加できる。In-Fusion Snap Assembly Master Mixによって線状DNAの3'末端から塩基が除去され、2個のDNA断片間で生じる相補的塩基によりアニーリングが可能となり、DNA断片の結合が起こる。この原理により1個から複数の断片のクローニングが可能となる。さらに、変異導入、遺伝子合成、特定遺伝子領域の変換などにも利用できる。
In-Fusion Snap Assembly Master Mixは、In-Fusion HD Cloning Kitのバージョンアップ品であり、In-Fusion HDや他社同タイプキットと比べてクローニング効率が向上している。

他社同等品との違いはこちら
In-Fusionと他社シームレスクローニングキットは何が違うの？


図1．プロトコール

1. 利用するベクターの末端配列に相同な15塩基を、目的遺伝子増幅用プライマーの5'末端に付加し、目的遺伝子をPCR増幅する。
2. 増幅産物がシングルバンドであればカラム精製、またはCloning Enhancer処理を行い、複数のバンドが見られる場合はゲルから精製して、In-Fusion酵素で線状化ベクター^*と結合する（In-Fusion反応：50℃、15分）。
   Cloning Enhancer（製品コード 639613～639615）は、PCR産物をそのままIn-Fusion反応に使用するための独自の前処理試薬である。PCR終了後の反応液に本試薬を加えて30分間インキュベートするだけで、そのままIn-Fusion反応に使用できる。PCR産物の精製ステップが不要となり、試料のロスも少なくなる。
3. In-Fusion反応液で形質転換を行い、目的クローンをスクリーニングする。

* 線状化ベクターは、制限酵素処理や全長のPCR増幅により調製してください。

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In-Fusionクローニング用プライマーの設計および目的DNA断片の増幅は、基本的に通常のPCRプライマーの設計、PCR増幅と同じである。唯一の違いは、利用するベクターの末端配列に相同な15塩基を、配列特異的プライマーの5’末端に付加することである（下図参照）。

お手持ちのベクターに対するIn-Fusion用プライマーの設計には、便利なオンラインツール「In-Fusion クローニング用プライマー設計サイト（In-Fusion Cloning Primer Design Tool）」をご利用ください。

※ リンク先はTB USA社サイトです。デザインツールが更新され、より使いやすくなりました。


※ これまでお使いいただいていた「In-Fusionクローニング用プライマー設計サイト（Primer Design tool for In-Fusion）」はこちらから

図3．In-Fusion HDとの比較
In-Fusion Snap AssemblyとIn-Fusion HDを使用し、インバースPCRで予め線状化した2.7 kbのベクターに5つの異なるサイズのインサート（405 bpから1,005 bpまで）を同時にクローニングした。各クローニング反応を3連で行い、得られたコロニー数を比較した。クローニングの正確性を確認するため、形質転換およびプレーティング後、各レプリケートから10個のコロニーを選択してシーケンスを行い、目的の配列が正しく挿入されているかを確認した。
In-Fusion Snap Assemblyを使用した場合、In-Fusion HDの4倍以上のコロニーが得られた。また、選択したコロニーのうち90％以上に正しい配列が挿入されていることを確認した。


図4．他社同タイプキットとの比較（インバースPCRによりベクターを線状化）
In-Fusion Snap Assemblyと他社同タイプキット（他社製品A）を用いて、3.8 kb インサートDNA（グラフA）または34.2 kbアデノウイルスDNA（グラフB）を2.7 kb線状化ベクターへクローニングした。クローニング反応はそれぞれ3連で行った。形質転換後、各反応からそれぞれ20コロニーについて、シーケンス（グラフA）またはコロニーPCR（グラフB）によりクローニング精度を調べた。
In-Fusion Snap Assemblyを使用した場合、他社製品Aの2倍以上のコロニーが得られた。また、選択したコロニーのうち95％以上に正しい配列が挿入されていることを確認した。


図5．他社同タイプキットとの比較（制限酵素処理によりベクターを線状化）
In-Fusion Snap Assemblyと他社同タイプキット（他社製品A）を用いて、制限酵素処理により作成された5'突出末端（グラフA）、平滑末端（グラフB）、3'突出末端（グラフC）の単一インサート（3.8 kb）を線状化された標準的なベクターにクローニングした。クローニング反応を3連で行い、得られたコロニー数を比較した。各レプリケートから20個のコロニーを選択してシーケンスを行い、目的の配列が正しく挿入されているかを確認した。
In-Fusion Snap Assemblyを使用した場合、他社同タイプキットの5倍～16倍以上のコロニーが得られた。また、選択したコロニーのうち95%以上に正しい配列が挿入されていることを確認した。

In-Fusion Snap Assembly Master Mix^※ （製品コード 638947、638948、638949、638943、638944）

• 5X In-Fusion Snap Assembly Master Mix
• pUC19 Control Vector, linearized
• 2 kb Control Insert

In-Fusion Snap Assembly Master Mix with Competent Cells^※ （製品コード 638951、638952）

• 5X In-Fusion Snap Assembly Master Mix
• pUC19 Control Vector, linearized
• 2 kb Control Insert
• pUC19 Vector
• SOC Medium
• Stellar Competent Cells（製品コード 636763）

※ PCR産物の精製には別途、NucleoSpin Gel and PCR Clean-up（製品コード 740609.10）などの精製用スピンカラムをご用意ください。なお、PCRによるインサートDNAの作製やベクターのインバースPCRにはPrimeSTAR Max DNA Polymerase（製品コード R045A/B）やTaKaRa Ex Premier DNA Polymerase（製品コード RR370A/B、RR371A/B）のご使用をおすすめします。

638947、638948、638949、638943、638944：−20℃
638951、638952
　　competent cells：−80℃
　　その他のコンポーネント：−20℃