RNAの5’末端にm7G cap構造（Cap 0）を付加する酵素
反応用バッファー添付
- 5’-triphosphate RNAへの7-methylguanylate (m7G) cap付与（Cap 0構造）
製品説明
Vaccinia Capping Enzyme（VCE）は、vacciniaウイルス由来のキャップ化酵素であり、RNA（5’-triphosphate RNA）の5’末端に7-methylguanylate cap構造（Cap 0）を付加します。真核生物においてキャップ構造は、mRNAの安定化、核外輸送、および翻訳において重要です。2つのサブユニット（D1およびD12）からなる本酵素は、3つの酵素活性（RNAトリホスファターゼ、グアニリルトランスフェラーゼ、およびグアニンメチルトランスフェラーゼ）を持ち、本製品に含まれる試薬（10× Capping Buffer、S-adenosylmethionine (SAM)、およびGTP）と共に用いることで、完全なCap 0構造を持つRNAをin vitroにおいて調製できます。
また、本酵素をmRNA Cap 2’-O-Methyltransferase（製品コード 2470A/B）と同時に用いることで、Cap-0 RNAの1番目のヌクレオチドの2’-O部位がメチル化されたCap 1構造を持つRNAをシングルステップ反応で調製することも可能です（使用例-2をご参照ください）。
また、本酵素をmRNA Cap 2’-O-Methyltransferase（製品コード 2470A/B）と同時に用いることで、Cap-0 RNAの1番目のヌクレオチドの2’-O部位がメチル化されたCap 1構造を持つRNAをシングルステップ反応で調製することも可能です（使用例-2をご参照ください）。
用途
- in vitro transcription（IVT）などで合成したRNAの5'-capping（Cap 0付与）
- mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase（2'-O-MTase）との併用による、5'-triphosphate RNAのシングルステップでのCap 1構造付与
- 5'末端標識mRNAの調製
内容
| Vaccinia Capping Enzyme (10 U/μl) | 500 U |
| 10× Capping Buffer | 100 μl |
| S-adenosylmethionine (SAM) (32 mM) | 100 µl |
| GTP (10 mM) | 50 µl |
保存
－20℃
濃度
10 U/μl
起源
Escherichia coli carrying plasmids containing the genes for vaccinia virus capping enzyme
一般的性質
質量：約98 kDaおよび33 kDa（ヘテロダイマー）
活性の定義
37℃において1時間に10 pmolの[α-32P]GTPをRNA転写物に取り込む酵素量を1 Uとする。
活性測定用反応液組成
| 1× | Capping Buffer | |
| 1 μM | GTP | |
| 10 μCi/ml | [α-32P]GTP | |
| 0.67 mM | SAM | |
| 2.5 μg/50 μl | 100 nt RNA |
品質管理データ
性能試験結果については、各ロットのCertificate of Analysis（CoA）をご覧ください。CoAはhttps://catalog.takara-bio.co.jp/search/doc_index.phpからダウンロードできます。
注意事項
- 本酵素の激しい攪拌は行わないでください。
- 鋳型となるRNAや試薬、反応に使用するチューブ、マイクロピペット用チップなどにRNaseが混入した場合、反応後に得られるRNAの収量が低下したり、RNAが断片化します。反応に使用するチューブ、マイクロピペット用チップは専用のものとし、反応を行うときはディスポーザブル手袋を着用して、RNaseが混入しないように注意してください。
使用例
＜使用例-1（Uncapped RNA（5'-triphosphate RNA）からCap-0 RNAの調製）＞
37℃で30分インキュベーションする。*4
| Denatured RNA transcript (10 μg)*1、4 | 15 μl | |
| 10× Capping Buffer | 2 μl | |
| GTP (10 mM) | 1 μl | |
| SAM (2 mM, dilute 32 mM stock to 2 mM)*2 | 1 μl | |
| Vaccinia Capping Enzyme (10 U/μl) | 1 μl | |
| Total | 20 μl | *3 |
37℃で30分インキュベーションする。*4
＜使用例-2（Uncapped RNA（5'-triphosphate RNA）からCap-1 RNAの調製）＞
37℃で1時間インキュベーションする。*4
| Denatured RNA transcript (10 μg)*1、4 | 14 μl | |
| 10× Capping Buffer | 2 μl | |
| GTP (10 mM) | 1 μl | |
| SAM (4 mM, dilute 32 mM stock to 4 mM)*2 | 1 μl | |
| Vaccinia Capping Enzyme (10 U/μl) | 1 μl | |
| mRNA Cap 2’-O-Methyltransferase (50 U/μl) | 1 μl | |
| Total | 20 μl | *3 |
37℃で1時間インキュベーションする。*4
| *1 | 使用するRNA（5’-triphosphate RNA）は5’末端が複雑な2次構造を取る場合に備え、反応前に熱変性する。 ＜熱変性＞
|
||||
| *2 | SAMは不安定であるため、反応前に必要分を32 mMのストック溶液からRNase-free waterで希釈調製する。希釈液は反応まで氷上で保存する。 | ||||
| *3 | 必要に応じてスケールアップ可能。 | ||||
| *4 | RNAの長さが200 nt以下である場合は、cap付加効率（およびメチル化効率）を上げるため反応時間を延長する（Cap-0 RNA調製：30分→1時間、Cap-1 RNA調製：1時間→2時間）。 |
| 注： | 反応液中のRNAを安定的に保つため、RNase inhibitorが使用できます。使用する場合は、最終濃度が1 U/μlとなるように添加してください。 |
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- 注意事項
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