AAVpro^® Helper Free System (AAV-CRE Recombinase)

アデノ随伴ウイルス（Adeno Associated Virus: AAV）は、アデノウイルスやヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスの存在下で増殖する非エンベロープウイルスです。アデノ随伴ウイルスベクター（AAVベクター）は文部科学省の定める省令（「研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を定める省令」平成16年文部科学省・環境省令第1号）にあるP1レベルの施設で取扱いが可能であり、アデノウイルスベクターやレトロウイルスベクターと比較して、安全で取扱いの容易なウイルスベクターとして知られています。AAVベクターは増殖／非増殖のいずれの細胞にも遺伝子導入が可能であり、特に非分裂細胞においては長期間の発現が可能です。また、免疫原性が低く、動物個体への遺伝子導入にも適しています。

AAVには100を超える血清型が存在しており、血清型の違いによって宿主域やウイルスの持つ特徴が異なることが知られています。血清型2（AAV2）は古くから広く研究されてきた血清型の1つであり、宿主域が大変広いという特長を持っています。血清型1（AAV1）、血清型5（AAV5）、血清型6（AAV6）、血清型8（AAV8）、血清型9（AAV9）は、より高い組織指向性を持った血清型です。AAV1は筋肉、肝臓、気道、中枢神経系等、AAV5は中枢神経系、肝臓、網膜等、AAV6は心臓、筋肉、肝臓等、AAV8は肝臓、筋肉、中枢神経系等、AAV9は中枢神経系、心臓、肝臓、筋肉等への遺伝子導入効率が高いと言われています。

本製品は、loxP依存的なrecombinaseであるCre遺伝子を搭載した血清型1、2、5、6、8、9のAAVベクターを、ヘルパーウイルスを使用せずに安全に作製するためのキットです。調製されたAAV-Cre recombinaseベクターは、トランスジェニックマウスの作製や様々なスクリーニング系で広く使用することができます。

図1．AAV2-Creベクターの細胞株への遺伝子導入
loxP-ZsGを発現する293細胞にAAV2-Creベクターを感染すると、loxP依存的な組換えが起こり、stuffer配列が除かれることで下流のZsGreenが発現する。


図2. AAV2-Creベクター感染細胞のFACS結果
調製したAAV2-CreベクターをAAVpro Purification Kit (AAV2)（製品コード 6232）を利用して精製し、loxP-ZsGを発現する293細胞に感染した。AAV2-Creベクターの感染量に依存して蛍光を発する細胞集団が増加した。

本製品では、Creリコンビナーゼ遺伝子搭載AAVベクターの作製に必要な複数のプラスミドをAAVpro 293T Cell Line（製品コード 632237）にトランスフェクションすることで、簡便にCreリコンビナーゼ遺伝子搭載AAVベクターを作製することができます。ここで必要なコンポーネントは、以下の3種類のプラスミドです。

• pAAV-CRE Recombinase Vector　CRE Recombinase遺伝子と2つのITR を含むベクタープラスミド
• pRC Vector　AAV2のRep遺伝子および各血清型のCap遺伝子を含むプラスミド
• pHelper Vector　アデノウイルス由来のE2A、E4、VAを含むプラスミド

さらに、従来の凍結融解法や超音波破砕法ではなく、タカラバイオが独自に開発したAAV Extraction Solutionを用いて、AAVベクター産生細胞からベクターを調製することにより、宿主由来のタンパク質や核酸の混入を抑え、効率的かつ簡便にAAVベクターを抽出することができます。抽出試薬はAAVpro Extraction Solution（製品コード 6235）としても販売しています。また、AAVベクターの精製は、AAVpro Purification Kit Maxi/Midi (All Serotypes)（製品コード 6666/6675）やAAVpro Cell ＆ Sup. Purification Kit Maxi (All Serotypes)（製品コード 6676）、AAVpro Freeze-Thaw Extraction Buffer (All Serotypes) （製品コード 6679）やAAVpro Purification Kit (AAV2)（製品コード 6232：血清型2のAAVベクターに対応）を用いて行うことができます。


図3．本システムによるAAVベクター作製

各製品には3種類のプラスミドとAAVベクター産生細胞からのベクター抽出に必要な2種類の試薬が含まれています。

AAVpro Helper Free System (AAV2-CRE Recombinase)（製品コード 6652）の場合

1. pAAV-CRE Recombinase Vector（1 μg/μl）　　20 μl
2. pRC2-mi342 Vector（1 μg/μl）^＊1　　20 μl
3. pHelper Vector（1 μg/μl）　　20 μl
4. AAV Extraction Solution A　　1.5 ml×3本
5. AAV Extraction Solution B　　150 μl×3本

＊1	その他のAAVpro Helper Free Systemも各血清型に対応したpRC Vectorがセットになっています。

ZIP形式で圧縮しております。

• pAAV-CRE Recombinase（fastaデータ）
• pHelper（fastaデータ）
• pHelper-Km（fastaデータ）
• pRC1（fastaデータ）
• pRC5（fastaデータ）
• pRC6（fastaデータ）
• pRC2-mi342（fastaデータ）
• pRC8（fastaデータ）
• pRC9（fastaデータ）

－20℃
ただし、AAV Extraction Solution AおよびAAV Extraction Solution Bは融解後、室温保存

器具・装置

• 細胞培養に必要な一般的設備
• 100 mmφ細胞培養用表面処理ディッシュ

試薬類

• 下記のうちいずれかのトランスフェクション試薬
  
  1. CalPhos Mammalian Transfection Kit（製品コード 631312）
  2. Xfect Transfection Reagent（製品コード 631317）
  3. TransIT-293 Transfection Reagent（製品コード MIR2704）
• Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM） 4.5 g/l Glucose with L-Glutamine（584 mg/l）
• Fetal Bovine Serum（FBS）
• Trypsin EDTA
• HEK293もしくはHEK293T細胞［AAVpro 293T Cell Line　（製品コード 632273）］
• 0.5 M EDTA（pH8.0）［EDTA Buffer Powder, pH8.0（製品コード T9191）］
• 下記のうちいずれかのポジティブコントロール用ベクター
  pAAV-ZsGreen1 Vector（製品コード 6231）
  pAAV-ZsGreen1 Vector (KmR)（製品コード 6610）

動物個体への遺伝子導入のためにAAVベクターを大量作製する場合は、高容量トランスフェクション用プラスミドセット（AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9）や臨床開発での使用を想定した、カナマイシン耐性遺伝子を有したAAVベクター高容量プラスミドセット（AAV2、AAV6、AAV8、AAV9）の使用をお薦めします。
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本製品をご利用の際は、以下の点にご注意ください。

• 本製品の使用には文部科学省の定める省令（「研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を定める省令」平成16年文部科学省・環境省令第1号）にあるP1レベル以上の施設が必要です。
• 本製品ご利用の際は省令および組織内の組換えDNA実験安全委員会の指示に従い、安全には十分ご注意ください。
• 本アデノ随伴ウイルスベクターの系によって生産されるウイルスは挿入断片によっては危険なウイルスを含む恐れがあるため、組換えアデノ随伴ウイルスベクターの生産と取扱いには、適切な処置をとる必要があります。吸入や付着を防ぐため、必ず、安全キャビネットを使用してください。
• 本製品の使用には遺伝子工学と細胞培養に関する基本的な技術が必要です。

遺伝子導入実験ハンドブック

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ぱっとわかる！ウイルスベクター選択ガイド

遺伝子導入試薬 選択ガイド（Mirus社）