shRNA発現AAVベクタ―の作製に
- ヘルパーウイルスを使用せずに、安全にRNA polymerase III (pol III)系プロモーターを搭載した血清型1、2、5、6、8のアデノ随伴ウイルスベクターを作製
- AAVpro Helper Free System (AAV-2xU6)は2種類のshRNAを発現させることが可能
製品説明
アデノ随伴ウイルス（Adeno Associated Virus：AAV）は、アデノウイルスやヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスの存在下で増殖する非エンベロープウイルスである。アデノ随伴ウイルスベクター（AAVベクター）は文部科学省の定める省令（「研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を定める省令」平成16年文部科学省・環境省令第1号）にあるP1レベルの施設で取扱いが可能であり、アデノウイルスベクターやレトロウイルスベクターと比較して、安全で取扱いの容易なウイルスベクターとして知られている。AAVベクターは増殖／非増殖のいずれの細胞にも遺伝子導入が可能であり、特に非分裂細胞においては長期間の発現が可能である。また、免疫原性が低く、動物個体への遺伝子導入にも適している。
AAVには100を超える血清型が存在しており、血清型の違いによって宿主域やウイルスの持つ特徴が異なることが知られている。血清型2（AAV2）は古くから広く研究されてきた血清型の1つであり、宿主域が大変広いことが知られている。血清型1（AAV1）、血清型5（AAV5）、血清型6（AAV6）、血清型8（AAV8）は、より高い組織指向性を持った血清型である。AAV1は筋肉、肝臓、気道、中枢神経系等、AAV5は中枢神経系、肝臓、網膜等、AAV6は心臓、筋肉、肝臓等、AAV8は肝臓、筋肉、中枢神経系等への遺伝子導入効率が高いと言われている。
遺伝子発現を抑制するひとつの手法としてRNA 干渉作用（RNA interference：RNAi）がある。RNAiは二本鎖RNA を導入することにより、標的遺伝子のmRNAを分解し、発現を抑制する手法で、哺乳類細胞では21～23塩基の短い二本鎖RNA（short interferingRNA：siRNA）によってRNAi効果が得られることが明らかとなっている。RNAi 実験の主な手法としては、合成siRNAを導入する方法と、発現ベクターを用いて細胞内でsiRNAを形成させる方法が挙げられる。合成siRNAではそのRNAi 効果は一過性であるが、発現ベクターを用いることでRNAi効果の持続が期待できる。
AAVpro Helper Free System (AAV-2xU6)は、RNA polymerase III（pol III）系のプロモーターを搭載した各血清型のAAVベクターをヘルパーウイルスを使用せずに安全に作製するためのキットである（AAV Helper Free System）。本製品により作製されるAAVベクターを用いることにより、標的細胞や標的動物個体においてヘアピン型RNAを一過性に発現させることができる。また、動物個体において使用する場合は、精製したAAVベクターの使用を推奨する。
AAVには100を超える血清型が存在しており、血清型の違いによって宿主域やウイルスの持つ特徴が異なることが知られている。血清型2（AAV2）は古くから広く研究されてきた血清型の1つであり、宿主域が大変広いことが知られている。血清型1（AAV1）、血清型5（AAV5）、血清型6（AAV6）、血清型8（AAV8）は、より高い組織指向性を持った血清型である。AAV1は筋肉、肝臓、気道、中枢神経系等、AAV5は中枢神経系、肝臓、網膜等、AAV6は心臓、筋肉、肝臓等、AAV8は肝臓、筋肉、中枢神経系等への遺伝子導入効率が高いと言われている。
遺伝子発現を抑制するひとつの手法としてRNA 干渉作用（RNA interference：RNAi）がある。RNAiは二本鎖RNA を導入することにより、標的遺伝子のmRNAを分解し、発現を抑制する手法で、哺乳類細胞では21～23塩基の短い二本鎖RNA（short interferingRNA：siRNA）によってRNAi効果が得られることが明らかとなっている。RNAi 実験の主な手法としては、合成siRNAを導入する方法と、発現ベクターを用いて細胞内でsiRNAを形成させる方法が挙げられる。合成siRNAではそのRNAi 効果は一過性であるが、発現ベクターを用いることでRNAi効果の持続が期待できる。
AAVpro Helper Free System (AAV-2xU6)は、RNA polymerase III（pol III）系のプロモーターを搭載した各血清型のAAVベクターをヘルパーウイルスを使用せずに安全に作製するためのキットである（AAV Helper Free System）。本製品により作製されるAAVベクターを用いることにより、標的細胞や標的動物個体においてヘアピン型RNAを一過性に発現させることができる。また、動物個体において使用する場合は、精製したAAVベクターの使用を推奨する。
図1. AAVpro Helper Free SystemによるAAVベクター作製
本シリーズでは異なるプラスミドベクター骨格や血液型の異なる6種類のshRNA発現用キットを用意している。AAVpro Helper Free System (AAV-U6-ZsGreen1)シリーズ（製品コード 6670、6658、6659、6660、6685）はshRNA以外にCMVプロモーターから緑色蛍光タンパク質であるZsGreen1が発現するため導入の確認や導入細胞だけでの評価が可能である。AAVpro Helper Free System (AAV-2xU6)シリーズ（製品コード 6671、6661、6662、6663、6684）は、2種類のshRNAを発現させることができ、2種類のターゲットもしくは1種類のターゲットに2か所のsiRNAを設計できる。
図2. ヘアピン型RNA発現ベクター
shRNA発現によるノックダウン効果の確認例
図3. shRNA発現によるノックダウン効果の確認
蛍光タンパク質に対するshRNAを発現するAAV2ベクター(pAAV-U6-ZsGreen1使用)を蛍光タンパク質を安定的に発現する細胞に感染させた結果、感染回数依存的にノックダウン効果が向上した。
内容
各製品には3種類のプラスミドとAAVベクター産生細胞からのベクター抽出に必要な2種類の試薬が含まれている。
AAVpro Helper Free System (AAV2-2xU6)（製品コード 6661）の場合
＊1 AAVpro Helper Free System (AAV1-2xU6)（製品コード 6671）ではpRC1 Vector、AAVpro Helper Free System (AAV5-2xU6)（製品コード 6662）ではpRC5 Vector、AAVpro Helper Free System (AAV6-2xU6)（製品コード 6663）ではpRC6 Vector、AAVpro Helper Free System (AAV8-2xU6)（製品コード 6684）ではpRC8 Vectorである。
AAVpro Helper Free System (AAV2-U6-ZsGreen1)（製品コード 6658）の場合
＊2 AAVpro Helper Free System (AAV1-U6-ZsGreen1)（製品コード 6670）ではpRC1 Vector、AAVpro Helper Free System (AAV5-U6-ZsGreen1)（製品コード 6659）ではpRC5 Vector、AAVpro Helper Free System (AAV6-U6-ZsGreen1)（製品コード 6660）ではpRC6 Vector、AAVpro Helper Free System (AAV8-U6-ZsGreen1)（製品コード 6685）ではpRC8 Vectorである。
AAVpro Helper Free System (AAV2-2xU6)（製品コード 6661）の場合
| 1. | pAAV-2xU6 Vector（1 μg/μl） | 20 μl |
| 2. | pRC2-mi342 Vector（1 μg/μl）＊1 | 20 μl |
| 3. | pHelper Vector（1 μg/μl） | 20 μl |
| 4. | AAV Extraction Solution A | 1.5 ml×3本 |
| 5. | AAV Extraction Solution B | 150 μl×3本 |
AAVpro Helper Free System (AAV2-U6-ZsGreen1)（製品コード 6658）の場合
| 1. | pAAV-U6-ZsGreen1 Vector (1 μg/μl) | 20 μl |
| 2. | pRC2-mi342 Vector (1 μg/μl)＊2 | 20 μl |
| 3. | pHelper Vector (1 μg/μl) | 20 μl |
| 4. | AAV Extraction Solution A | 1.5 ml×3本 |
| 5. | AAV Extraction Solution B | 150 μl×3本 |
各ベクターのシーケンスデータ
ZIP形式で圧縮しております。
保存
－20℃
ただし、AAV Extraction Solution AおよびAAV Extraction Solution Bは融解後、室温保存
ただし、AAV Extraction Solution AおよびAAV Extraction Solution Bは融解後、室温保存
キット以外に必要な主な器具・試薬
- 器具・装置
・細胞培養に必要な一般的設備
・100 mmφ細胞培養用表面処理ディッシュ - 試薬類
・In-Fusion HD Cloning Kit（製品コード 639648など）
・下記のうちいずれかのトランスフェクション試薬
a. CalPhos Mammalian Transfection Kit（製品コード 631312）・ Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM） 4.5 g/l Glucose with L-Glutamine（584 mg/l）
b. Xfect Transfection Reagent（製品コード 631317）
c. TransIT-293 Transfection Reagent（製品コード MIR2704）
・ Fetal Bovine Serum（FBS）
・ Trypsin EDTA
・ HEK293もしくはHEK293T細胞［AAVpro 293T Cell Line （製品コード 632273）］
・ 0.5 M EDTA（pH8.0）［EDTA Buffer Powder, pH8.0（製品コード T9191）］
・ pAAV-ZsGreen1 Vector（製品コード 6231：ポジティブコントロール用）
大量作成を行う場合
動物個体への遺伝子導入のためにAAVベクターを大量作製する場合は、高容量トランスフェクション用プラスミドセット
AAVpro Packaging Plasmid (AAV1）（製品コード 6672）、
AAVpro Packaging Plasmid (AAV2）（製品コード 6234）、
AAVpro Packaging Plasmid (AAV5）（製品コード 6664）、
AAVpro Packaging Plasmid (AAV6）（製品コード 6665）、
AAVpro Packaging Plasmid (AAV8）（製品コード 6681）が便利である。
使用上の注意
本製品をご利用の際は、以下の点にご注意ください。
- 本製品の使用には文部科学省の定める省令（「研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を定める省令」平成16年文部科学省・環境省令第1号）にあるP1レベル以上の施設が必要です。
- 本製品ご利用の際は省令および組織内の組換えDNA実験安全委員会の指示に従い、安全には十分ご注意ください。
- 本アデノ随伴ウイルスベクターの系によって生産されるウイルスは挿入断片によっては危険なウイルスを含む恐れがあるため、組換えアデノ随伴ウイルスベクターの生産と取扱いには、適切な処置をとる必要があります。吸入や付着を防ぐため、必ず、安全キャビネットを使用してください。
- 本製品の使用には遺伝子工学と細胞培養に関する基本的な技術が必要です。
関連資料
関連のオンラインガイドはこちら
Protocols
Application
AAV2ベクターを用いたマウス脳線条体への遺伝子導入
【参考データ】pRC2-mi342 Vector使用によるAAV2ベクタータイター向上効果
【参考データ】AAV Extraction SolutionによるAAV2ベクター抽出効果
Technical Notes
アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターによる遺伝子導入
組換えウイルス発現系選択ガイド
アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターによる遺伝子導入 参考文献
アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターによる遺伝子導入 使用文献
AAVpro® Purification Kit Midi (All Serotypes) のモニター結果のご紹介
使用文献・参考文献
関連製品・受託
AAVpro® Purification Kit Maxi/Midi (All Serotypes)
AAVpro® Purification Kit (AAV2)
AAV qPCR（リアルタイムPCR）迅速タイタ―測定キット
AAVpro® Helper Free System
AAVpro® Helper Free System (AAV-LacZ)
AAVpro® Helper Free System (AAV-CRE Recombinase)
AAVpro® Extraction Solution
pAAV-ZsGreen1 Vector
AAVpro® 293T Cell Line
- 注意事項
- 本ページの製品はすべて研究用として販売しております。ヒト、動物への医療、臨床診断用には使用しないようご注意ください。また、食品、化粧品、家庭用品等として使用しないでください。
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