AAVpro^® Helper Free System

AAVpro Packaging Plasmid (KmR)シリーズ製品のご購入に際しては、添付の購入確認書に必要事項をご記入の上、ご注文の際に弊社販売店までお渡しください。本確認書が添付されていない場合は製品の出荷ができませんのでご注意ください。
ご質問は下記へご連絡ください。

アデノ随伴ウイルス（Adeno Associated Virus：AAV）は、アデノウイルスやヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスの存在下で増殖する非エンベロープウイルスです。アデノ随伴ウイルスベクター（AAVベクター）は文部科学省の定める省令（「研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を定める省令」平成16年文部科学省・環境省令第1号）にあるP1レベルの施設で取扱いが可能であり、アデノウイルスベクターやレトロウイルスベクターと比較して、安全で取扱いの容易なウイルスベクターとして知られています。AAVベクターは増殖／非増殖のいずれの細胞にも遺伝子導入が可能であり、特に非分裂細胞においては長期間の発現が可能です。また、免疫原性が低く、動物個体への遺伝子導入にも適しています。

AAVには100を超える血清型が存在しており、血清型の違いによって宿主域やウイルスの持つ特徴が異なることが知られています。血清型2（AAV2）は古くから広く研究されてきた血清型の1つであり、宿主域が大変広いことが知られています。血清型1（AAV1）、血清型5（AAV5）、血清型6（AAV6）、血清型8（AAV8）、血液型9（AAV9）は、より高い組織指向性を持った血清型です。AAV1は筋肉、肝臓、気道、中枢神経系等、AAV5は中枢神経系、肝臓、網膜等、AAV6は心臓、筋肉、肝臓等、AAV8は肝臓、筋肉、中枢神経系等、AAV9は中枢神経系、心臓、肝臓、筋肉等への遺伝子導入効率が高いと言われています。
タカラバイオでは血清型1、2、5、6、8、9のAAVベクター作成用キット（AAV Helper System）を用意しており、本製品により作製されるAAVベクターを用いることにより、標的細胞や標的動物個体において目的遺伝子を一過性に発現させることができます。

AAV Helper Free Systemはヘルパーウイルスを使用せずに高タイターなAAVベクターを作製する独自のシステムです（図1）。本製品では、AAVベクターの作製に必要な複数のプラスミドをHEK293細胞、もしくはHEK293T細胞にトランスフェクションすることで、簡便にAAVベクターを作製することができます。ここで必要なコンポーネントは、以下の3種類のプラスミドです。

• pAAV-CMV Vector　CMVプロモーターとその下流に目的遺伝子を挿入するためのMCS、および2つのITRを含むベクタープラスミド
• pRC Vector　AAV2のRep遺伝子および各血清型のCap遺伝子を含むプラスミド
• pHelper Vector　アデノウイルス由来のE2A、E4、VAを含むプラスミド

さらに、従来の凍結融解法や超音波破砕法ではなく、タカラバイオが独自に開発したAAV Extraction Solutionを用いて、AAVベクター産生細胞からベクターを調製することにより、宿主由来のタンパク質や核酸の混入を抑え、効率的かつ簡便にAAVベクターを抽出することができます。抽出試薬はAAVpro Extraction Solution（製品コード 6235）としても販売しています。また、AAVベクターの精製は、AAVpro Purification Kit Maxi/Midi (All Serotypes)（製品コード 6666/6675）やAAVpro Cell ＆ Sup. Purification Kit Maxi (All Serotypes)（製品コード 6676）、AAVpro Freeze-Thaw Extraction Buffer (All Serotypes) （製品コード 6679）、AAVpro Purification Kit (AAV2)（製品コード 6232：血清型2のAAVベクターに対応）を用いて行うことができます。


図1．本システムによるAAVベクター作製

1．組換えアデノ随伴ウイルスベクターの作製
2．組換えアデノ随伴ウイルスベクターの抽出

各システムには3種類のプラスミドとAAVベクター産生細胞からのベクター抽出に必要な2種類の試薬が含まれています。

AAVpro Helper Free System (AAV2)（製品コード 6230）の場合

1.	pAAV-CMV Vector（1 μg/μl）＊1	20 μl
2.	pRC2-mi342 Vector（1 μg/μl）＊2	20 μl
3.	pHelper Vector（1 μg/μl）	20 μl
4.	AAV Extraction Solution A	1.5 ml×3本
5.	AAV Extraction Solution B	150 μl×3本

＊1	pAAV-CMV Vectorに挿入できる目的遺伝子のサイズは2.5 kbまでです。
＊2	その他のAAVpro Helper Free Systemも各血清型に対応したpRC Vectorがセットになっています。

Ready-to-Useの高容量トランスフェクション用プラスミド（コンポーネント2と3をセット）の別売り製品もあります。

AAVpro Packaging Plasmid （AAV2）（製品コード 6234）の場合

• pRC2-mi342 Vector^＊3 (1 μg/μl)　　　0.5 ml×2本
• pHelper Vector (1 μg/μl)　　　　　　0.5 ml×2本

＊3 その他のAAVpro Packaging Plasmidも各血清型に対応したpRC Vectorがセットになっています。

※AAVpro Packaging Plasmid (AAV2) (KmR)（製品コード6266）のpRC2-Km vectorには、AAV2 ベクター作製系でタイター向上効果のあるhsa-miR-342 （miRNA）発現カセットは含まれません。

ZIP形式で圧縮しております。

• pAAV-CMV（fastaデータ）
• pHelper（fastaデータ）
• pHelper-Km（fastaデータ）
• pRC1（fastaデータ）
• pRC5（fastaデータ）
• pRC6（fastaデータ）
• pRC2-mi342（fastaデータ）
• pRC8（fastaデータ）
• pRC9（fastaデータ）
• pRC2-Km（fastaデータ）
• pRC6-Km（fastaデータ）
• pRC8-Km（fastaデータ）
• pRC9-Km（fastaデータ）

－20℃
ただし、AAV Extraction Solution AおよびAAV Extraction Solution Bは融解後、室温保存

器具・装置

• 細胞培養に必要な一般的設備
• 100 mmφ細胞培養用表面処理ディッシュ

試薬類

• 下記のうちいずれかのトランスフェクション試薬
  1. CalPhos Mammalian Transfection Kit（製品コード 631312）
  2. Xfect Transfection Reagent（製品コード 631317）
  3. TransIT-293 Transfection Reagent（製品コード MIR2704）
• Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM） 4.5 g/l Glucose with L-Glutamine（584 mg/l）
• Fetal Bovine Serum（FBS）
• Trypsin EDTA
• HEK293もしくはHEK293T細胞［AAVpro 293T Cell Line　（製品コード 632273）］
• 0.5 M EDTA（pH8.0）［EDTA Buffer Powder, pH8.0（製品コード T9191）］
• 下記のうちいずれかのポジティブコントロール用ベクター
  pAAV-ZsGreen1 Vector（製品コード 6231）
  pAAV-ZsGreen1 Vector (KmR)（製品コード 6610）

動物個体への遺伝子導入のためにAAVベクターを大量作製する場合は、高容量トランスフェクション用プラスミドセット（AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9）や臨床開発での使用を想定した、カナマイシン耐性遺伝子を有したAAVベクター高容量プラスミドセット（AAV2、AAV6、AAV8、AAV9）の使用をお薦めします。

本製品をご利用の際は、以下の点にご注意ください。

• 本製品の使用には文部科学省の定める省令（「研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を定める省令」平成16年文部科学省・環境省令第1号）にあるP1レベル以上の施設が必要です。
• 本製品ご利用の際は省令および組織内の組換えDNA実験安全委員会の指示に従い、安全には十分ご注意ください。
• 本アデノ随伴ウイルスベクターの系によって生産されるウイルスは挿入断片によっては危険なウイルスを含む恐れがあるため、組換えアデノ随伴ウイルスベクターの生産と取扱いには、適切な処置をとる必要があります。吸入や付着を防ぐため、必ず、安全キャビネットを使用してください。
• 本製品の使用には遺伝子工学と細胞培養に関する基本的な技術が必要です。

遺伝子導入実験ハンドブック

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ぱっとわかる！ウイルスベクター選択ガイド

遺伝子導入試薬 選択ガイド（Mirus社）