簡単・便利なクローニングキットがバージョンアップ！
- 任意のベクターの任意の位置にディレクショナルクローニングが可能
- 制限酵素不要の簡単プロトコール
- 0.5～15 kbインサートについて、95％以上の高効率でクローニングが可能
- 既存品In-Fusion HD Cloning Kitに比べ、一挙に複数DNA断片を挿入するマルチクローニングの効率が向上
- 高い正確性を維持したまま、他社同タイプキットより多くのコロニーを取得
製品説明
In-Fusion Snap Assembly Master Mixは、わずか15分間の反応で、1個～複数のPCR断片を任意のベクターの任意のサイトへ設計通りにクローニングできるキットである。クローニングするPCR断片に対し、制限酵素処理、リン酸化、平滑末端化は不要である。クローニング効率が95％以上であるため、ハイスループットなどのスケールアップも可能である。
In-Fusion反応では、PCR断片と線状化ベクターの両末端15塩基の相同配列を利用して効率よくクローニングする。この15塩基の相同配列はPCR用プライマーの設計により容易に付加できる。In-Fusion Snap Assembly Master Mixによって線状DNAの3'末端から塩基が除去され、2個のDNA断片間で生じる相補的塩基によりアニーリングが可能となり、DNA断片の結合が起こる。この原理により1個から複数の断片のクローニングが可能となる。さらに、変異導入、遺伝子合成、特定遺伝子領域の変換などにも利用できる。
In-Fusion Snap Assembly Master Mixは、In-Fusion HD Cloning Kitのバージョンアップ品であり、In-Fusion HDや他社同タイプキットと比べてクローニング効率が向上している。
他社同等品との違いはこちら
In-Fusionと他社シームレスクローニングキットは何が違うの？
図1．プロトコール
In-Fusion反応では、PCR断片と線状化ベクターの両末端15塩基の相同配列を利用して効率よくクローニングする。この15塩基の相同配列はPCR用プライマーの設計により容易に付加できる。In-Fusion Snap Assembly Master Mixによって線状DNAの3'末端から塩基が除去され、2個のDNA断片間で生じる相補的塩基によりアニーリングが可能となり、DNA断片の結合が起こる。この原理により1個から複数の断片のクローニングが可能となる。さらに、変異導入、遺伝子合成、特定遺伝子領域の変換などにも利用できる。
In-Fusion Snap Assembly Master Mixは、In-Fusion HD Cloning Kitのバージョンアップ品であり、In-Fusion HDや他社同タイプキットと比べてクローニング効率が向上している。
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In-Fusionと他社シームレスクローニングキットは何が違うの？
図1．プロトコール
In-Fusionプライマーの設計
In-Fusionクローニング用プライマーの設計および目的DNA断片の増幅は、基本的に通常のPCRプライマーの設計、PCR増幅と同じである。唯一の違いは、利用するベクターの末端配列に相同な15塩基を、配列特異的プライマーの5’末端に付加することである（下図参照）。
お手持ちのベクターに対するIn-Fusion用プライマーの設計には、便利なオンラインツール「In-Fusion HDプライマー設計サイト（Primer Design tool for In-Fusion）」をご利用ください。
お手持ちのベクターに対するIn-Fusion用プライマーの設計には、便利なオンラインツール「In-Fusion HDプライマー設計サイト（Primer Design tool for In-Fusion）」をご利用ください。
性能比較データ
図2．In-Fusion HDとの比較
In-Fusion Snap AssemblyとIn-Fusion HDを使用し、インバースPCRで予め線状化した2.7 kbのベクターに5つの異なるサイズのインサート（405 bpから1,005 bpまで）を同時にクローニングした。各クローニング反応を3連で行い、得られたコロニー数を比較した。クローニングの正確性を確認するため、形質転換およびプレーティング後、各レプリケートから10個のコロニーを選択してシーケンスを行い、目的の配列が正しく挿入されているかを確認した。
In-Fusion Snap Assemblyを使用した場合、In-Fusion HDの4倍以上のコロニーが得られた。また、選択したコロニーのうち90％以上に正しい配列が挿入されていることを確認した。
図3．他社同タイプキットとの比較（インバースPCRによりベクターを線状化）
In-Fusion Snap Assemblyと他社同タイプキット（他社製品A）を用いて、3.8 kb インサートDNA（グラフA）または34.2 kbアデノウイルスDNA（グラフB）を2.7 kb線状化ベクターへクローニングした。クローニング反応はそれぞれ3連で行った。形質転換後、各反応からそれぞれ20コロニーについて、シーケンス（グラフA）またはコロニーPCR（グラフB）によりクローニング精度を調べた。
In-Fusion Snap Assemblyを使用した場合、他社製品Aの2倍以上のコロニーが得られた。また、選択したコロニーのうち95％以上に正しい配列が挿入されていることを確認した。
図4．他社同タイプキットとの比較（制限酵素処理によりベクターを線状化）
In-Fusion Snap Assemblyと他社同タイプキット（他社製品A）を用いて、制限酵素処理により作成された5'突出末端（グラフA）、平滑末端（グラフB）、3'突出末端（グラフC）の単一インサート（3.8 kb）を線状化された標準的なベクターにクローニングした。クローニング反応を3連で行い、得られたコロニー数を比較した。各レプリケートから20個のコロニーを選択してシーケンスを行い、目的の配列が正しく挿入されているかを確認した。
In-Fusion Snap Assemblyを使用した場合、他社同タイプキットの5倍～16倍以上のコロニーが得られた。また、選択したコロニーのうち95%以上に正しい配列が挿入されていることを確認した。
内容
- 5X In-Fusion Snap Assembly Master Mix
- linearized pUC19 Control Vector
- 2 kb Control Insert
※ PCR産物の精製には別途、NucleoSpin Gel and PCR Clean-up（製品コード 740609.10）などの精製用スピンカラムをご用意ください。
※ キットにはコンピテントセルが添付されていません。形質転換には、効率の高いE. coli HST08 Premium Competent Cells（製品コード 9128）などをご利用ください。
※ PCRによるインサートDNAの作製やベクターのインバースPCRには正確性が高いPrimeSTAR Max DNA Polymerase（製品コード R045A/B）の使用をおすすめします。
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