Guide-it™ Recombinant Cas9 (3 µg/µl)

Guide-it Recombinant Cas9 (3 μg/μl) は、野生型Streptococcus pyogenes由来のCRISPR/Cas9ゲノム編集用の組換えCas9タンパク質溶液である。
溶媒中のグリセロール濃度が他社Cas9より低いので、特にエレクトロポレーションによる導入に最適である。Cas9遺伝子を使用するベクターベースの導入法に比べ、遺伝子の残存によるCas9の継続的な発現がないため、オフターゲット効果を抑制できる。
タンパク質への転写・翻訳・発現の過程がなく、C末にNLS（核移行シグナル）が付加されているため、迅速かつ効率よく変異導入が行える。
細胞などへの導入にはCas9とsgRNAの複合体（RNP）を形成する必要があるが、sgRNAの調製にはGuide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit（製品コード 632635）もしくはGuide-it Complete sgRNA Screening System（製品コード 632636）の使用を推奨する。
本製品はトランスフェクション試薬による導入も可能であり、Mirus Bio社TransIT-X2 Dynamic Delivery Systemを推奨している（実施例はこちら）。

GMPグレードの組換え型Cas9タンパク質Recombinant Cas9 Protein GMP grade（製品コード T230）はこちら

3 μg/μl

－70℃
（注）凍結融解は繰り返さない。最初に融解した後、使用する量を分注して保存するのが望ましい。

・エレクトロポレーション用装置：
Neon Transfection System（Thermo Fisher Scientific社）または 4-D Nucleofector System（Lonza社）
※各装置での導入条件については、取扱説明書（英語）をご覧ください

・精製sgRNA
　Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit（製品コード 632635）：sgRNAの調製および精製に使用
　Guide-it Complete sgRNA Screening System（製品コード 632636）：調製したsgRNAの有効性の確認に使用

AAVS1およびCXCR4遺伝子の相同組換え（HDR）効率
Hind III切断サイトを含んだRepair OligoをAAVS1 geneに、また、Hind IIIおよびBamH I切断サイトを含んだRepair OligoをCXCR4 geneにノックインするため、本製品を使用し、エレクトロポレーションでCD34^＋造血幹細胞への導入実験を行った。
細胞内の各ターゲット遺伝子をPCRで増幅し、各制限酵素で切断して、挿入効率を確認した。
（CXCR4には編集前の野生型の遺伝子にBamH Iサイトが1か所ある。）


hiPS細胞における遺伝子のノックアウトおよび他社Cas9との比較
Guide-it Recombinant Cas9 (3 μg/μl)とGuide-it sgRNA In Vitro Transcription Kitを用いて作製したsgRNAをエレクトロポレーションで導入して、各ターゲット遺伝子のゲノム編集実験を行った。
変異導入効率の確認にはGuide-it Mutation Detection Kit（製品コード 631448）を使用し、各％は切断効率を示している。