Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (low dsRNA)

1. Cloning Kit for mRNA Template (BspQ I) （製品コード 6133）：
   本製品はIVTでのmRNA合成を意図したプレデザイン済みのIn-Fusionクローニング用ベクター、In-Fusion試薬およびアッセイコントロールフラグメント（FLuc）から構成されています。
   予め線状化されたベクターには、T7 promoter、転写開始配列（AGG）、5’-UTR (untranslated region)、3’-UTR、Poly(A) 配列（141塩基）が含まれているため、発現させたい遺伝子のコーディング配列（coding sequence: CDS）をIn-Fusionクローニングするだけで、ヒトやマウスといった哺乳類細胞で使用可能なmRNA合成用鋳型プラスミドを構築できます。構築したプラスミドはPoly(A)配列直後に導入したType IIS制限酵素・BspQ Iサイトで線状化することにより、Poly(A)配列後に余分な配列を持たないmRNAの合成鋳型となります。


2. Takara IVTpro T7 mRNA Synthesis Kit (low dsRNA)（製品コード 6134）：
   本製品は構築した鋳型プラスミドを用いてin vitro transcription（IVT）により、免疫原性のあるdsRNAの生成を大幅に低減しつつ、高品質・高収量なmRNAを合成するキットです。真核生物における効率的なタンパク質の翻訳にはRNAの5’末端にCap構造を必要としますが、本製品ではCleanCap Reagent AG（TriLink社：Code. N-7113）などを用いて、Cap構造を持つmRNAを効率よく調製することができます。また、本製品で作製したmRNAに、Faustovirus Capping Enzyme (S17)（製品コード 2480A/B）あるいはVaccinia Capping Enzyme（製品コード 2460A/B）とmRNA Cap 2’-O-Methyltransferase（製品コード 2470A/B）を用いることにより、酵素反応的にCap1構造を付加することも可能です。さらに、導入細胞での免疫原性を低減させたい場合は、通常のUTPの代わりにシュードUTP等もmRNAの収量を大きく低下させることなく使用することができます。
   詳しくは、Takara IVTpro mRNA Synthesis System (low dsRNA)（製品コード 6131）の取扱説明書をご参照ください。
   
   
   
   ＊従来品のCleanCapアナログ（＋）での値を100％とし,その相対値をグラフに示す。
   
   図1. FLuc mRNA（約1.9 kb）を合成した際の収量とdsRNAの含有量およびタンパク発現レベル
   Positive Control Template (FLuc)を鋳型として、本製品（Takara IVTpro mRNA Synthesis System (low dsRNA)（製品コード 6131））と従来品（Takara IVTpro T7 mRNA Synthesis System（製品コード 6141））および他社製品を用いて、CleanCapアナログ有無の条件にて標準プロトコールに従いIVT結果を比較した（グラフでは各製品に含まれるT7 RNA polymeraseの名称を示す）。
   その結果、（A）本製品・従来品ともにCleanCapアナログの有無に関わらずmRNA合成収量は高く、さらに（B）本製品ではdsRNAの生成が従来品と比べ約95％抑えられたことが確認できた。
   また、（C）合成したmRNAをHEK293T細胞にトランスフェクションし、FLucアッセイによってタンパク質の細胞内発現レベルを測定した結果、本製品で合成されたmRNAはタンパク質発現レベルが高いことが確認された。

• IVTの鋳型に使用するプラスミドDNAのコンストラクション
• Poly(A) 配列後に余分な配列を持たないmRNAの合成
• TriLink社のCleanCap Reagent AGを用いるIVTでのmRNA合成
• Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) などのCapアナログを用いたcapped mRNAの合成
  （※ARCAの使用に際しては本製品とは異なる鋳型配列のデザインが必要になりますので、ご注意ください。）
• Long non-coding RNAの合成
• guide RNAの合成
• siRNA前駆体の合成
• RT-qPCR用RNA標準鋳型の合成
• 高標識RNAプローブの合成

• 本製品はIVT反応によってRNAを合成する試薬です。鋳型となる二本鎖DNAや試薬、反応に使用するチューブ、マイクロピペット用チップなどにRNaseが混入した場合、RNA収量の低下やRNAの断片化を引き起こします。反応に使用するチューブ、マイクロピペット用チップは専用のものとし、反応を行うときはディスポーザブル手袋を着用して、RNaseが混入しないように注意してください。
• 使用する酵素類は、氷上においてください。また、過度の攪拌や凍結融解は行わないでください。
• Lithium Chloride Precipitation Solutionは使用前に室温で融解してください。融解後、よく混合しても沈殿物が見られる場合、37℃で溶液を温めてください。それでも沈殿物が残る場合は、そのままご使用ください。性能に影響はありません。

• 形質転換用のコンピテントセル・試薬など
• CleanCap Reagent AG（TriLink社）
• シュードUTP等の修飾ヌクレオチド
• 制限酵素（BspQ I）

• Linearized Template Vector (BspQ I) ：2,962 bp
  配列情報（fasta形式）：こちらからダウンロードできます。


• FLuc Control Fragment (BspQ I) ：1,683 bp
  配列情報（fasta形式）：こちらからダウンロードできます。

ベクター情報：Positive Control Template (FLuc)

配列情報（fasta形式）：こちらからご確認ください。
Positive Control Template（FLuc）（4,574 bp）

NeoR/KanR: 193～987
Ori: 1,312～1,900

T7 promoter sequence: 2,629～2,645
Transcription Start Sequence (AGG): 2,646～2,648
5’UTR: 2,649～2,699
FLuc CDS: 2,700～4,352
3’UTR: 4,353～4,465
Poly(A)₁₀₅ : 4,466～4,570
(FLuc Control Fragment-derived sequence: 2,685～4,367)

▼Linearized site by Hind III (5' overhangs) : 4,569 (4,573)

＜T7 promoter sequence以降の詳細情報＞