Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System

1. ① Cloning Kit for mRNA Template（製品コード 6143）：
   IVTでのmRNA合成を意図したプレデザイン済みのIn-Fusionクローニング用ベクター、In-Fusion試薬およびアッセイコントロールフラグメント（FLuc）から構成されています。予め線状化されたベクターには、T7 promoter、転写開始配列 (AGG)、5’-UTR (untranslated region)、3’-UTR、Poly(A)配列（A×105塩基）が含まれているため、発現させたい遺伝子のコーディング配列（coding sequence：CDS）をIn-Fusionクローニングするだけで、ヒトやマウスといった哺乳類細胞で使用可能なCleanCap Reagent AGを用いたmRNA合成用鋳型プラスミドを構築できます。mRNA合成用プラスミドの線状化にはHind IIIの使用を推奨します。ただし、Hind IIIで切断した場合もPolyA配列の下流に、余分な配列が3塩基残ります。
   また、必要に応じて配列を改変してご利用いただくことも可能です。Linearized Template Vectorの配列情報はこちらよりご確認ください。
   
   ＜BspQ Iを利用する“scarless”mRNA合成＞
   BspQ Iを利用する“scarless”mRNA合成にはCloning Kit for mRNA Template (BspQ I)（製品コード 6133）をご利用ください。
   ベクター情報詳細はこちら
2. ② Takara IVTpro T7 mRNA Synthesis Kit（製品コード 6144）：
   T7 promoter配列を含む二本鎖DNAを鋳型として、IVT 反応によりmRNAを合成するためのキットです。IVT反応後に鋳型DNAを消化するためのDNase Iや合成されたmRNAを精製するための塩化リチウム（LiCl）溶液も含まれています。真核生物における効率的なタンパク質への翻訳にはRNAの5’末端にCap構造を必要としますが、本製品ではCleanCap Reagent AG（TriLink社：Code. N-7113-1/5/10）などを用いて、Cap構造を持つmRNAを効率よく調製することができます。また、導入細胞での免疫原性を低減させたい場合は、mRNAの収量を大きく低下させることなく、通常のUTPの代わりにシュードUTP等を使用することもできます。詳しくは、Takara IVTpro T7 mRNA Synthesis Kit（製品コード 6144）の取扱説明書をご参考ください。
   本製品を用いることで、1反応（20 μl反応系）あたり最大200 μg以上のRNA合成が可能です。また、必要量に応じてスケールアップも可能で、10倍スケールの200 μl反応系とした場合でも、mRNA合成収量の直線性（収量の期待値）に問題がないことを確認済みです（取扱説明書もしくはApplication参照）。

• IVTの鋳型に使用するプラスミドDNAのコンストラクション
• TriLink社のCleanCap Reagent AGを用いるIVTでのmRNA合成
• Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) などのCapアナログを用いたcapped mRNAの合成
  （※ARCAの使用に際しては本製品とは異なる鋳型配列のデザインが必要になりますので、ご注意ください）
• Long non-coding RNAの合成
• guide RNAの合成
• siRNA前駆体の合成
• RT-qPCR用RNA標準鋳型の合成
• 高標識RNAプローブの合成

• 本製品はIVT反応によってRNAを合成する試薬です。鋳型となる二本鎖DNAや試薬、反応に使用するチューブ、マイクロピペット用チップなどにRNaseが混入した場合、反応後に得られるRNAの収量が低下したり、RNAが断片化します。反応に使用するチューブ、マイクロピペット用チップは専用のものとし、反応を行うときはディスポーザブル手袋を着用して、RNaseが混入しないように注意してください。
• 10× Enzyme Mixは、激しい攪拌や混和を避けてご使用ください。
• Lithium Chloride Precipitation Solutionは使用前に室温で融解してください。融解後、よく混合しても沈殿物が見られる場合、37℃で溶液を温めてください。それでも沈殿物が残る場合は、そのままご使用ください。性能に影響はありません。

• CleanCap Reagent AG（TriLink社）
• シュードUTP等の修飾ヌクレオチド
• 制限酵素（Hind III、BspQ Iなど）

ベクター情報：Positive Control Template（FLuc）

Positive Control Template（FLuc）（4,574 bp）

NeoR/KanR: 193～987
Ori: 1,312～1,900

T7 promoter sequence: 2,629～2,645
Transcription Start Sequence (AGG): 2,646～2,648
5’UTR: 2,649～2,699
FLuc CDS: 2,700～4,352
3’UTR: 4,353～4,465
Poly(A)₁₀₅ : 4,466～4,570
(FLuc Control Fragment-derived sequence: 2,685～4,367)

▼Linearized site by Hind III (5' overhangs) : 4,569 (4,573)

＜T7 promoter sequence以降の詳細情報＞